急性呼吸窘迫综合征大鼠血小板丝裂原活化蛋白激酶p38磷酸化水平

刘 宏，范晓枝，田新强，李 冰

（1.山西大同大学呼吸病与职业病研究所，山西大同037009；2.山西医科大学第一临床医学院呼吸科，山西太原030001；3.山西省临汾市中心医院呼吸科，山西临汾041000）

急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是临床常见的急危重症，占全球重症监护病房所有患者的10.4%[1]。近年来支持治疗的进展使其28 d的死亡率降低到了33%，但有效疗法的确定仍然难以捉摸[2]。虽然人们已经进行了几十年的研究，但对ARDS的发病机理仍然不是很清楚。本课题组既往对ARDS进行了一些研究，注意到此时血液中有高凝状态，抑制血小板聚集的一些药物对ARDS有一定的治疗作用[3-4]。本文介绍的内容，是在既往研究的基础上，针对ARDS发病时血小板激活的信号通路进行的一次研究。

1 材料和方法

1.1 动物模型的建立和取样

本次实验选用SD大鼠，体重250～400 g，共30只。将其分成5组，其中实验组4组（油酸2 h组，油酸6 h组，油酸24 h组，油酸72 h组），对照组1组。实验组通过尾静脉注射油酸d的办法（0.25mL/kg）制作ARDS实验模型，对照组则注射等剂量生理盐水。分别在注油酸后的2、6、24、72 h，注盐水后的2 h，采血进行血小板分离，将动物处死做相关病理检查。

1.2 肺系数计算和肺病理学检查

在各时间点处死动物，开胸取肺，对肺的大小、表面状况、弹性等进行观察。之后，称肺湿重并算出肺系数（肺湿重/体重×100）。然后，分离左右肺，将左肺用福尔马林溶液（10%）浸泡一周后按常规方法做病理切片，HE染色，光镜下观察；右肺称湿重，再置80℃烤箱中烘干，计算肺湿重/干重比值（R w/d）。

1.3 血小板丝裂原活化蛋白激酶p38（p38 MAPK）磷酸化水平测定

在各时点处死动物时，在腹主动脉上段采血10 mL，分离血小板后提取血小板蛋白,再用免疫印迹法测定血小板中p38 MAPK的磷酸化水平。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 动物状态

动物在注油酸2～3 min后出现明显的呼吸困难，进食进饮减少，活动减少，呈瘫软无力状和爬行步态。24 h后上述表现好转，72 h后大致恢复原状。对照组未见异常表现。

2.2 肺系数和Rw/d

各组大鼠肺系数和R w/d变化见附表1。表中显示，油酸2～24 h组肺系数及Rw/d均有增加，以2 h组最明显。对照组未见异常改变。

表1 对照组和各实验组动物肺系数及Rw/d比值(±s)

表1 对照组和各实验组动物肺系数及Rw/d比值(±s)

注:*与对照组比较，P＜0.05。

分组(n)对照组油酸2h组油酸6h组油酸24组油酸72组肺湿/干重比(n=6)3.3±0.36.0±0.6*5.6±0.2*5.3±1.4*4.8±0.7*肺湿重(n=6)2.2±0.74.8±1.1*4.1±0.8*3.6±0.3*2.4±0.3*体重(n=6)354.2±60.2368.5±46.0372.8±39.6406.7±40.0252.5±5.2肺系数(n=6)0.6±0.11.3±0.2*1.1±0.1*0.9±0.1*0.9±0.1*

2.3 肺病理学变化

2.3.1 肉眼观察

对照组肺脏大小正常，柔软，表面光滑，粉红色，小叶纹理清晰。油酸组动物，双肺肿胀，重量增加。其中2 h、6 h、24 h组，肺脏肿胀明显，外观呈紫红色、花斑状；72 h组，肺脏肿胀有所减轻，弹性差，表面不平，呈灰白色。

2.3.2 光镜观察

对照组动物肺组织结构正常，肺泡腔内无渗出物，肺泡间隔无增厚。油酸组，2 h、6 h、24 h组有程度不同的肺泡水肿和肺间质水肿，肺泡腔内可见大量炎细胞渗出和染色深红、均匀一致的透明膜形成，有肺泡出血和肺间质出血，肺间质有炎细胞浸润和小血管扩张及充血；72 h组动物，肺泡腔炎细胞和液体渗出物大部吸收，肺泡腔狭窄，肺泡隔增厚，肺间质炎细胞浸润减少，有纤维组织增生和微血栓形成。

2.4 血小板p38 MAPK磷酸化水平

如图1所示，2～72 h油酸组动物，血小板p38 MAPK磷酸化水平均高于对照组，以2 h最高，其后逐步下降；除24 h与72 h组外，其余各组两两比较均有差异，且差异具有统计学意义（P＜0.05）。

3 讨论

ARDS的轻症或早期阶段曾被称作急性肺损伤（acute lung injury，ALI），其病死率高，在美国接近50%[5]。近年引起一定程度恐慌的病毒感染性疾病如严重急性呼吸综合征（SARS）、H5N1型禽流感和H1N1甲型流感，均可引起ARDS[6]。尽管对ARDS的有效治疗方法有限，但如能及时识别ARDS并使用肺保护性机械通气策略治疗，可降低死亡率。然而，ARDS的临床诊断经常被延误或错过，导致治疗迟缓，治疗不足或治疗不适当[7]。

图1 各组动物血小板p38 MAPK磷酸化水平

血小板是哺乳动物特有的、无核的、多功能血细胞，在生理状态下，主要作用是参与止血。尽管传统上认为血小板在止血中起着核心作用，许多研究清楚地表明这些血液成分是有效的免疫调节剂和效应物。已显示血小板直接识别、隔离和杀灭病原体，激活并将白细胞募集至感染部位和炎症部位，并调节白细胞行为，增强其吞噬和杀死病原体并诱导独特效应功能的能力。这种对感染和炎症的多方面反应，部分归因于大量可溶性介质和由血小板表达的细胞表面分子。从他们最早起源于无脊椎动物的原始血细胞到它们现在的巨核细胞衍生的细胞质形式，血小板已经发展成为宿主血管内免疫和炎症的关键调节剂之一[8-10]。

血小板和肺有密切的关系，其持续循环通过肺血管并且在止血和炎症中具有主要的效应物活性。肺是巨核细胞的储存器，而巨核细胞是血小板生成中必需的前体细胞，因此肺是血小板的贮存池和生产场所。肺脏参与产生血小板的复杂过程。在受到刺激时，肺脏可释放血小板。血小板有助于肺泡毛细血管的基础屏障完整性，调节肺血管的渗透性，选择性地限制水、蛋白质和红细胞从血管中转移出来。血小板也有助于肺血管修复。因此，血小板在保持肺的防御功能及其完整性方面十分重要。但是，尽管可以增强健康肺部的止血和炎症防御，血小板也是多种肺部疾病和综合征的损伤效应物[11]。Zhao J等人的实验表明，与输注新鲜血小板相比，给小鼠输注储存的血小板会引起更严重的肝脏和肺组织损伤[12]。在疾病的早期阶段检测肺癌，对于提高患者的生存率可能至关重要。有必要用新型敏感性和特异性生物标志物以及可以替代使用的早期检测，补充当前的常规诊断程序。最近，液体活组织检查证实了其在晚期非小细胞肺癌中的临床用途。来自液体活组织检查的不同生物资源，包括受肿瘤教育的血小板（tumor-educated platelets，TEP）也因其在肺癌诊断中的潜在作用而被广泛研究[13]。实验研究和临床证据表明，在ARDS肺泡损伤的发生、发展过程中，活化的血小板起重要作用。它可促进肺泡毛细血管膜的损伤，增加血管的渗透性，促进肺水肿的形成。血小板数量和功能的改变，会影响ARDS的自然病史[6,11]。

血小板在ARDS肺病理变化中的作用已经引起了人们的关注，但其时血小板活化的机制及信号通路还不清楚。近来发现，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）与肺部疾病有密切的关系。MAPK是细胞跨膜信号转导下游的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，包括c-Jun N末端蛋白激酶（JNKs）、细胞外调节的蛋白激酶（ERKs）和p38激酶（p38 MAPK）3个亚家族。大多数细胞中存在MAPKs信号转导途径，该途径在将细胞外的刺激信号转导入细胞及其细胞核并引起细胞生物反应中起关键作用。已经发现在高等哺乳动物的细胞中有多个平行的MAPKs信号传导途径，不同的细胞外刺激可以用不同的MAPKs信号传导途径。通过这些信号通路的相互调节，来介导不同的细胞生物反应。Vallese D等人[14]研究了稳定期慢性阻塞性肺疾病（COPD）病人、轻度哮喘患者和对照受试者支气管活检组织中磷酸化p38 MAPK（p-p38MAPK）的免疫组织化学表达，发现稳定期COPD病人与对照受试者的pp38MAPK表达相似；与稳定期COPD病人和对照受试者相比，哮喘患者的p-p38MAPK表达增加。Vallese D等还在体外实验中用过氧化氢（H2O2）和脂多糖（LPS）处理了支气管上皮，发现其中的p38 MAPK mRNA显着增加，表明p38 MAPK可能在COPD恶化期间有潜在作用。国内刘力兴等[15]用PCR荧光检测法测定COPD患者外周血单个核细胞中p38 MAPK的表达情况，发现患者外周血单个核细胞核内p38 MAPK表达量高于对照组，提示p38 MAPK参与了COPD的炎症反应。朱保月等[16]发现，重症胰腺炎急性肺损伤大鼠肺组织磷酸化p38蛋白表达明显增高，p38抑制剂SB203580通过减轻肺组织中磷酸化p38的表达，从而减轻肺组织的损伤。

研究表明，MAPKs信号转导途径也是重要的血小板激活途径，该途径的激活可介导血小板释放、变形、黏附和聚集。但是，关于该途径在ARDS时血小板活化中作用的研究，目前很少见报道。本课题组在稍早些的研究中发现，血小板内MAPKs信号系统JNKs亚家族中的JNK蛋白激酶磷酸化水平明显增高[17]，ERKs亚家族中的MEK1蛋白激酶磷磷酸化水平明显增高[18]，p38激酶亚家族中的MKK3蛋白激酶磷酸化水平明显增高[19]。其中，MKK3是p38激酶的上游蛋白激酶，可特异性地激活p38激酶[20]。本次研究结果显示，2～72h油酸组动物，血小板p38 MAPK磷酸化水平均高于正常对照组，在2 h处达峰值，其后逐步下降，其变化规律与肺系数、肺湿/干重比值、肺组织病理变化规律大体一致。实验结果表明，ARDS时血小板的活化过程有MAPKs信号途径的启动，即MAPKs信号途径参与了ARDS血小板活化的过程。

血小板的活化是一个复杂的过程，其涉及的是复杂的信号网络，而不是简单的信号通路。血小板内有复杂的信号网络，这个网络可以对多种血小板激活剂如ADP、凝血酶、TXA2、胶原蛋白和肾上腺素等做出反应，这是血小板活化的基础[21]。对血小板信号传导途径的了解有助于已经进入临床实践或正在进行临床试验的抗血小板药物的开发，从而有利于将来ARDS的临床治疗。本次研究是对ARDS时血小板活化信号转导途径的部分探索，今后还有许多工作要做。