小鼠心肌缺血/再灌注损伤中TTC染色方法的改进及蛋白酶体作用机制的探讨

田 翠 来 松 徐多娇 侯翠柳 刘 洋 王红霞 杨 慧

缺血/再灌注(ischemia/reperfusion, I/R)损伤是在缺血的基础上恢复血流后组织损伤反而加重，甚至发生不可逆性损伤的现象[1]，其发生机制复杂，尚未完全明了。心肌梗死面积是评价心肌缺血/再灌注损伤的重要指标[2]。目前国内外研究中用于评价心肌梗死面积的染色方法主要是TTC染色(triphenyltetrazolium chloride，2，3，5-氯化三苯基四氮唑)[3-4]和TTC-Evans blue 双染方法。TTC-Evans blue双染的方法优点是能够确定梗死面积，危险区面积和非缺血区面积[5]，但其操作困难，失败率较高，并没有广泛使用。泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system, UPS)是细胞内蛋白质降解的主要途径，参与细胞内80%以上蛋白质的降解，其在心血管疾病中具有重要的病理生理学意义，本实验室前期研究结果提示泛素蛋白酶体系统参与了缺血/再灌注损伤过程[6]，但其作用仍需进一步探讨。本研究旨在优化目前的TTC-Evans blue双染方法，并探讨蛋白酶体各个亚基在I/R损伤中的作用。

材料与方法

1.实验材料 SPF，雄性，C57BL/6J(野生型, WT)小鼠，8周，16只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(动物许可证号SCXK(京) 20120001)，随机分为两组：①假手术组(Sham组)；②心肌缺血/再灌注组(I/R组)。

2.主要试剂 TTC和Evens blue染料均购自美国Sigma 公司；抗β1单抗、抗β2单抗、抗β5单抗、抗β1i单抗、抗β2i单抗和抗β5i单抗均购自abcam 公司；羊抗鼠IgG 抗体-辣根过氧化物酶标记购自美国Santa Cruz 公司；Tween-20 等购自美国Sigma 公司；蛋白酶体活性检测试剂盒购自美国的Promage公司；Caspase 3 活性检测试剂盒购自碧云天生物技术有限公司，TUNEL染色试剂盒购自Roche公司。

3.小鼠心肌缺血再灌注模型建立 小鼠经三溴乙醇麻醉，固定，从左侧胸壁第4、5肋间打开胸腔，暴露心脏，在左冠状动脉前降支位置处结扎，使其缺血45min，后松开再灌注2h，复制I/R模型，Sham组小鼠仅将线穿过前降支，不结扎[7]。

4.TTC-Evans blue双染方法 重新结扎前降支，再迅速分离出主动脉弓，剪断主动脉放血，主动脉逆向注入1% Evans blue；快速剪取心脏，置放在冰0.9%氧化纳氢中，解开结扎的前降支，用平头带有凹槽的7号注射器针头逆行主动脉插管并固定；缓慢将37℃温浴的1%TTC溶液注入心脏，在37℃孵育3～4min；之后剪去心耳，向心腔内注入15%的藻酸盐糊剂固形，等干燥后，置于4%多聚甲醛中固定12～24h；将心脏置于切片模具中，浇以10%琼脂糖，待冷却后用薄刀片将其均匀切成5～6片(约1 mm)；按顺序正反面照相，用Image J软件计算梗死区、危险区、远端区及总面积。

5.组织总泛素化蛋白的表达检测 取心肌组织匀浆上清，SDS-PAGE 电泳后转至PVDF 膜，室温封闭60 min，孵育抗β1，β2，β5，β1i，β2i，β5i一抗(1∶1 000)，4℃过夜。TBST洗膜后，室温孵育羊抗鼠IgG 抗体-辣根过氧化物酶标记二抗60min，通过凝胶成像系统成像。

6.蛋白酶体活性及Caspase 3活性检测 取心肌组织匀浆上清，用专用黑色96 荧光检测板检测泛素26 S 蛋白酶体活性。糜蛋白酶、半胱天冬酶、胰蛋白酶活性检测时分别加入的特异抑制剂为：10nmol/L bortezomib、25μmol/L Ac- APnLD- al、20 mol/L leu-peptin。37℃，避光孵育2h，Tecan 光谱仪检测荧光，激发光和发射光波长分别是360nm和465nm，检测蛋白酶体各亚基活性；另取 50～200μg 组织匀浆上清，加入50μL 的2×Reaction Buffer，加入5μL Caspase-3 Substrate 并于37℃ ，避光孵育4h，酶标仪检测405nm吸光值测定Caspase-3 活性。

7.TUNEL染色 心脏在4%多聚甲醛中固定，然后用石蜡包埋、切片(厚度5μm)，按照罗氏试剂盒说明书进行TUNEL染色。采用Nikon Labophot2显微镜进行采图(×200)。选择6～8个视野，应用Image J软件统计每个视野中的细胞核数目及凋亡细胞数，计算凋亡细胞与总细胞的比值即为阳性凋亡百分数。

8.统计学方法 应用SPSS16.0 数据处理系统进行数据分析。计量资料以均数±标准差表示，各组间计量资料的比较采用单因素方差(one way ANOVA)分析。以P<0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1.改良的TTC-Evans blue双染法可以明确显示心肌I/R损伤时的形态学变化 在I/R模型上，采用改良的TTC-Evans blue双染方法可以明确显示梗死区(infarct area，呈白色)、危险区(area at risk, AAR，呈红色)和远端区(呈蓝色)面积。与sham组相比，I/R组梗死面积/危险区面积明显增加(32.6%，n=8，P<0.01)，sham组与I/R组危险区面积/总面积无显著差异，与文献报道一致[7](图1)。

图1 I/R损伤引起心肌细胞死亡心肌组织TTC染色结果，梗死区(Infarct Area)呈黄白色，危险区(AAR) 呈红色，远端区呈蓝色(n=8，* P <0.01)

2.I/R损伤后心肌细胞凋亡明显增多 TUNEL染色结果显示，I/R损伤引起心肌细胞凋亡数明显增加，是假手术组的5.47倍(n=8，P<0.01)；I/R损伤造成心肌组织中Caspase-3 的活性明显增高，为Sham组的2.8倍 (n=8，P<0.05,图2)。

图2 I/R损伤加重心肌细胞凋亡A：心肌组织TUNEL染色结果：α-actinin显示心肌细胞呈红色荧光；TUNEL染色显示凋亡的细胞呈绿色荧光；DAPI染色显示细胞核呈蓝色B：心肌组织Caspase-3活性测定结果(n=8，*P <0.05，**P<0.01)

3.I/R损伤后心肌细胞内蛋白酶体活性被抑制 为了探索心肌I/R损伤的发病机制，检测了I/R模型中危险区蛋白酶体肽酶活性变化。与Sham组相比，I/R组心肌组织蛋白酶体活性均降低，其中胰蛋白酶(β1)降低16%、半胱天冬酶(β2)降低6%、糜蛋白酶(β5) 降低32%，糜蛋白酶的变化有显著性差异(n=8，P<0.05,图3)。

图3 I/R损伤时心肌组织中蛋白酶体的活 性受到抑制(n=8，*P<0.05)

图4 I/R损伤时心肌组织中蛋白酶体及免疫蛋白酶体各亚基的表达降低(n=8，*P<0.05)

4.I/R损伤时心肌组织中蛋白酶体及免疫蛋白酶体各亚基的表达降低 进一步检测蛋白酶体亚基β1、β2、β5和免疫蛋白酶体β1i、β2i、β5i蛋白含量表达。I/R组组成型蛋白酶体亚基β1、β2、β5蛋白表达呈降低趋势，但差异无统计学意义，分别比sham组下降3%、6%和16%；而免疫蛋白酶体β1i、β2i、β5i蛋白表达显著降低，分别比sham组下降49%、48%和54%(n=8，P<0.05，图4)。

讨 论

TTC是一种脂溶性光敏感复合物，它是呼吸链中吡啶—核苷结构酶系统的质子受体，能与活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶反应，生成红色化合物，从而使有活力的细胞呈现红色。而死亡细胞由于脱氢酶活力已经消失，TTC无法还原，因此梗死组织呈现白色[5-6]。TTC染色的优点是操作简单，容易实施；缺点是不能保证缺血面积的均一性，迄今为止一直没有统一标准的实验步骤。TTC- Evans blue双染色的原理是在TTC染色的基础上加上Evans blue染色。Evans blue 是一种蓝色染料，主动脉逆行灌注染料能够到达心脏除结扎的前降支以外的其他血管，渗入组织，从而使未结扎区呈现蓝色。目前国内外发表的文章中两种方法均有应该，既然TTC-Evans blue双染明显优于TTC染色，为什么还没有被普遍使用？究其原因主要有两个：第一，通过主动脉逆行灌注Evans blue时，血管闭合或者压力太大，导致蓝色灌不进去，也容易导致用力过猛蓝色过度着色；第二，TTC染色时由于需要反复多次通过主动脉灌注TTC溶液，难以固定主动脉插管。针对存在的这些问题，本实验做了三点改进：首先，剪断主动脉放血，减轻主动脉及冠状动脉内的压力；其次，使用一种自制的头部带有橡胶圈的眼科镊固定主动脉，防止滑脱，将平头且带有凹槽的(便于固定)5 mL注射器针头逆行插入主动脉，并用打结固定，保证TTC溶液和Evans blue成功灌注；另外，心脏切片时使用一种小组织切片模具，以保证心脏切片平整，并且每个组织切片的厚度一致。改良的TTC-Evans blue双染方法可以更好地显示梗死区、危险区和远端区面积，为I/R损伤引起的心肌梗死机制的研究提供了可靠形态学的支持。

I/R损伤过程伴有大量细胞凋亡及死亡，伴随细胞内大量蛋白质的降解。真核细胞内80%的蛋白质被UPS降解。UPS主要包括泛素激活酶(E1)、泛素转运酶(E2)、泛素连接酶(E3)和26S蛋白酶体。其中26S蛋白酶体，由20S催化核心颗粒和19S调节颗粒组成[9]。20S核心颗粒含有3个具有酶活性的组成型催化亚基β1、β2、β5，分别具有类似半胱天冬酶(caspase-like)、胰蛋白酶(trypsin-like)和糜蛋白(chymotrypsin-like)三种肽酶的活性，它们在维持正常的细胞周期、细胞增殖、细胞生存等方面发挥着重要的作用[10-11]。在促炎症因子如γ干扰素(INF-γ)等刺激下，β1、β2、β5亚基可被诱导型催化亚基β1i、β2i、β5i取代，形成免疫蛋白酶体[12]。目前的研究已证实蛋白酶体参与缺血再灌注的发生[6]，但是蛋白酶体如何调节I/R损伤的机制尚不清楚，本实验初步探索了蛋白酶体功能与心肌I/R损伤的关系。改良的TTC-Evans blue双染色方法可以很好的显示心肌梗死区域(图1)，基于此，本实验还检测了心肌细胞的凋亡及Caspase-3活性，结果发现I/R促进了心肌细胞凋亡及Caspase-3活性的增加(图2)，与文献报道一致。有趣的是，危险区心肌组织中糜蛋白酶样活性显著降低(图3)，而且免疫蛋白酶亚基β1i、β2i、β5i蛋白表达显著下降(图4)。此结果提示，心肌I/R时细胞内蛋白酶体尤其是免疫蛋白酶功能严重受损，加重了心肌细胞的凋亡及坏死。

本实验改良了TTC-Evans blue双染的方法，使其易于操作，提高了染色的成功率，为心肌缺血坏死性疾病研究提供可靠的形态学支持。另外发现免疫蛋白酶体的功能抑制可能加重了I/R损伤的过程，为临床研究I/R损伤机制提供新的思路，为新药物的开发提供了靶点。