蟾蜍类药材质量研究△

刘美，冯杉，张娟，陈炫好，张生艳，李先宽*

（1.天津中医药大学，天津 300193；2.北京中医药大学东方学院，河北 廊坊 065001）

蟾蜍类药材蟾酥、干蟾、蟾衣来源于蟾蜍科动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor或黑眶蟾蜍Bufo melanostictus Schneider的耳后腺或皮肤腺分泌物、干燥全体及蟾蜍自然脱下的角质衣膜[1-3]。前两种均为国家药典或部颁标准收载的药材，作为抗肿瘤药物研究和使用的比较多，蟾衣作为一种从民间发掘的蟾蜍新药用资源，广泛用于治疗肝癌和消腹水等疾病，且毒性较低。蟾蜍类药材具有强心、升压抗休克、抗炎镇痛、麻醉、抗肿瘤、抗辐射、利尿、增强机体免疫力及改善循环等多种药理活性[4，5]。用于疮癀肿毒、咽喉肿痛、化脓性感染、急慢性炎症、急救昏迷、心力衰竭等症[6]，是蟾酥丸、麝香保心丸、六神丸等复方制剂中主要配伍药材。目前由于蟾蜍类药材市场需求量不断增加，吉林、江苏、山东等省份广泛分散的蟾蜍养殖没有形成统一规范的标准，导致蟾蜍类药材质量不均，不同来源-野生或养殖、不同生长年限、不同环境、不同生产加工方法导致药材质量不均一现象严重。本研究以不同产地的蟾蜍类药材蟾酥、干蟾、蟾衣为研究对象，对不同产地、不同生长年限的蟾蜍类药材中4种蟾毒配基类成分进行测定，旨在对不同产地蟾蜍类药材进行质量评价，并尝试性探索干蟾、蟾衣成分积累与生长年限之间的关系，为蟾蜍规范化养殖、药材质量均一化，合理开发、应用蟾蜍类药材资源提供理论依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

岛津LC-20AT型高效液相色谱仪，SPD-20A紫外-可见光检测器，SIL-20A自动进样器；Sartorius BT125D电子天平（十万分之一，赛多利斯科学仪器有限公司）；FA2004电子天平（万分之一，上海精天电子仪器有限公司）；循环水式多用真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；KDM型调温电热套（北京永兴精佳仪器有限公司）；KH3200B型超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司）。

1.2 试剂

对照品蟾毒灵、酯蟾毒配基、华蟾酥毒基（购自中国食品药品检定研究院，含量测定用，批号分别为111981-201501、110718-201108、110803-201406），蟾毒它灵（购自天津万象恒远科技有限公司，质量分数大于98%，批号20180115）。乙腈（色谱纯），甲醇（色谱纯），磷酸二氢钾（分析纯），磷酸（分析纯），水为重蒸馏水。

1.3 药材

药材信息见表1，供试样品1，2于2017年9月购于三棵树药材市场，样品3～6于2017年9月吉林省采集，样品7～12于2017年10月购于安徽亳州药材市场，共计12份样品，经天津中医药大学张坚博士鉴定为蟾酥、干蟾和蟾衣，基原动物为中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor。

表1 蟾蜍类药材样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为迪马Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5μm），流动相为乙腈（A）-0.5%磷酸二氢钾溶液（B），磷酸调节pH为3.2；梯度洗脱，0～15 min，30% ～61%B；15～30 min，61%B；30～32 min，30%B；检测波长296 nm，流速0.7 mL·min－1，柱温：30℃，进样量：20μL。混合标准品溶液和样品溶液的图谱见图1。

图1 蟾蜍药材对照品及样品的HPLC色谱图

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基对照品适量，精密称定，加甲醇制成含蟾毒它灵 0.050 3 mg·mL－1、蟾毒灵0.054 3 mg·mL－1、华蟾酥毒基0.084 mg·mL－1、酯蟾毒配基0.050 1 mg·mL－1的对照品溶液，摇匀，即得。

2.2.2供试品溶液的制备 取蟾酥药材细粉约25 mg，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

取干蟾药材粉末（过3号筛）2.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，加热回流1小时，过滤，浓缩回收甲醇，浓缩液用甲醇准确定容到5 mL，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

蟾衣药材细粉0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，加热回流1小时，过滤，浓缩回收甲醇，浓缩液用甲醇准确定容到5 mL，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3 线性关系考察

分别精密吸取 “2.2.1”4个对照品溶液适量，配制成不同浓度的对照品溶液，分别进样20μL，记录峰面积，以浓度为横坐标，以峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：蟾毒它灵：Y＝2.290 3X－0.402 6（r＝0.999 9），0.419 2～50.300 0μg·mL－1呈良好的线性关系；蟾毒灵：Y＝3.163 5 X－0.109 8（r＝0.999 9），0.010 8～54.300 0μg·mL－1呈良好的线性关系；华蟾酥毒基：Y＝2.759 6 X－0.6（r＝0.999 7），0.016 7～84.000 0μg·mL－1呈良好的线性关系；酯蟾毒配基：Y＝2.781 5 X－1.050 1（r＝0.999 6），0.009 9～50.100 0μg·mL－1呈良好的线性关系。

2.4 精密度试验

精确吸取4种对照品溶液各20μL，分别按2.1项下色谱条件测定各对照品峰面积5次积分值的RSD分别为：蟾毒它灵0.74%；蟾毒灵0.52%；华蟾酥毒基0.83%；酯蟾毒配基0.91%。仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验

取同一样品溶液在 0、3、5、7、9、12 h分别进样20μL，依次测定，结果6次测定峰面积的RSD分别为蟾毒它灵1.51%、蟾毒灵1.74%、华蟾酥毒基0.87%、酯蟾毒配基1.05%。结果表明，样品溶液在12 h内稳定。

2.6 重复性试验

取1号样品6份，按供试品溶液制备项操作，平行制备6份样品，按上述色谱条件测定，计算指标成分的平均含量为蟾毒它灵10.492 7 mg·g－1，峰面积RSD＝1.67%（n＝6）；蟾毒灵7.370 7 mg·g－1，RSD＝2.76%（n＝6）；华蟾酥毒基 17.734 7 mg·g－1，RSD＝1.70%（n＝6）；酯蟾毒配基 2.08 mg·g－1，RSD＝1.72%（n＝6）。结果表明，该方法的重复性良好。

2.7 加样回收率试验

取1号样品6份，每份约25 mg，2份为一组，分别精密加入高、中、低三个量的蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基对照品贮备液。按2.2.2项下制备供试品溶液，准确吸取供试品20μL进样，按2.1项下色谱条件测定，结果见表2。

表2 加样回收率试验结果

2.8 样品含量测定

称取1.3项下一定质量的蟾蜍类药材，精密称定，按2.2.2项下制备供试品溶液，按2.1项下色谱条件测定。每一样品进样3次，以外标法中的标准曲线法计算蟾蜍药材样品各成分含量。所得结果见表3。

表3 样品含量测定结果（mg·g－1，n＝3）

3 讨论

近年研究结果表明，蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基等蟾毒配基类成分在体内外对人肝癌、胃癌、肺癌、肠癌、鼻炎癌、前列腺癌、妇科肿瘤及胰腺癌等多种实体瘤生长均有良好的抑制活性[7-9]，其中华蟾酥毒基还具有治疗心血管疾病的药理作用[10]，同时蟾毒灵对正常细胞也具有一定的细胞毒性[11]。因此，本研究对蟾蜍类药材——蟾酥、干蟾皮、蟾衣中这四类成分进行了含量测定。4份市售蟾酥药材中指标成分含量测定结果表明，以华蟾酥毒基和脂蟾毒配基为标准，4份蟾酥药材样品华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的总量0.78%～1.99%，均未能满足2015年版 《中华人民共和国药典》规定的质量标准（华蟾酥毒基和脂蟾毒配基的总量＞6.0%）[1]。究其原因可能为因其市场价格较高每千克1万多元，蟾酥在市场流通过程中，可能被人为掺假。

干蟾是治疗肿瘤类疾病的地方药材，有毒。研究表明，干蟾中的蟾蜍二烯羟酸内酯类化合物具有明显的抗肿瘤活性。使用过程中多用于癌症的治疗及配合放、化疗，不仅能够有效抑制癌细胞的过度增殖，还具有减轻放、化疗毒副作用，改善血象的功效[12-14]。由本实验指标成分含量测定结果可知，吉林与山东干蟾药材样品中脂蟾毒配基与华蟾酥毒基含量差别较大，其中山东干蟾（大）样品，华蟾酥毒基含量最高为0.041 1 mg·g－1，山东干蟾（小）样品，脂蟾毒配基含量最高为0.017 3 mg·g－1。样品3与样品4，样品9与样品10含量测定结果对比表明，干蟾（小）样品中4种指标成分——蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基和脂蟾毒配基含量要明显高于干蟾（大）样品。

蟾衣作为一种民间药材研究较少，但其抗肝癌和消腹水作用在民间广为传用，且毒性很低。又因为蟾衣是蟾蜍自然脱下的角质外衣，可人工活体取衣循环利用，对蟾蜍不造成任何伤害，是一种很好的可持续利用中药新资源。本实验测得蟾衣中华蟾酥毒基平均含量为0.027 0 mg·g－1，脂蟾毒配基平均含量为0.031 3 mg·g－1；样品5与样品 6，样品11与样品12含量测定结果表明，蟾衣样品中4种指标成分含量因蟾蜍生长年限不同，其药材质量会产生差异；脂蟾毒配基含量：蟾衣（大）＜蟾衣（小），蟾毒灵：含量蟾衣（小）＜蟾衣（大）。因此，蟾衣作为微毒类药材，其用量可根据蟾蜍生长年限（或同基原蟾蜍蟾衣大小）的不同进行合理调整。