静息态fMRI观察恒河猴慢性酒精暴露模型诱导期后脑功能改变

李 燕，王 松，王海宝，余永强*

(1.安徽医科大学第四附属医院放射科，安徽 合肥 230022；2.安徽医科大学第一附属医院放射科，安徽 合肥 230022)

酒精对脑功能活动的影响一直是临床和科学研究的热点，国内已有采用静息态fMRI评价恒河猴和人类急性期酒精暴露及酒精依赖者脑功能活动改变的研究报道[1-3]，但鲜见对慢性酒精暴露静息态脑功能活动改变的动态过程研究。本研究建立恒河猴慢性酒精暴露模型，采用3.0T静息态fMRI，基于分数低频振荡幅度(fractional amplitude of low frequency fluctuations， fALFF)算法分析恒河猴慢性酒精暴露模型诱导期后脑功能活动改变，旨在为后续动态研究提供依据。

1 材料与方法

1.1实验动物 健康雄性恒河猴7只[由安徽医科大学动物实验中心购于河南省南阳市新野县新豫野生动物养殖有限公司(豫林护许准[2006]21号)]，年龄6～8岁，平均(7.0±1.0)岁，体质量6.5～17.5 kg，平均(10.79±3.55)kg。实验动物于恒温(20℃～22℃)、恒湿(65%)的共同房间中饲养，单只猴笼安置，10 h光照周期(上午8∶00点亮)。

1.2动物模型建立 采用Cosgrove等[4]报道的时间表程序诱导法建立恒河猴慢性酒精暴露模型，药物为绝对风味伏特加(每瓶700 ml，乙醇浓度为40%)，以蔗糖增甜，并用自来水稀释，给予实验动物每日24 h自由口服。乙醇初始浓度为0.2 g/kg体质量，喂养1周，后成倍递增至第5周(2～5周乙醇浓度分别为0.4、0.8、1.6、3.2 g/kg体质量)，之后按照第5周的浓度维持喂养，第5周喂养完成为诱导期结束。

1.3血液酒精浓度测定 诱导期结束后，fMRI前10 min，经小隐静脉抽取2 ml静脉血，以GC 2014C气相色谱仪(LTSJ-DW-A-001)检测血液酒精浓度。

1.4fMRI 酒精喂养前行静息态fMRI获取基线数据，以3%戊巴比妥钠(臀部肌肉注射，剂量1.2 ml/kg体质量)麻醉动物，以仰卧位保定于扫描床，监控呼吸，进行BOLD及3D结构像扫描；诱导期结束后再行静息态fMRI，参数同前。MR扫描前12 h停止酒精喂养，扫描结束后将动物安全送回动物房，清醒6 h后恢复饲食饲水。每次扫描前测量动物体质量。

采用GE Discovery 750W 3.0T MR扫描仪，头部16通道相控阵正交线圈。BOLD数据采用单次激发EPI序列行全脑轴位扫描，TR 2 000 ms，TE 35 ms，翻转角90°，FOV 24 cm×24 cm，层厚2.5 mm，层间距0.5 mm，矩阵64×64，层数26层；3D结构像采用快速扰相梯度翻转恢复序列行轴位扫描，TR 7.2 ms，TE 3.1 ms，翻转角8°，FOV 25.6 cm×25.6 cm，层厚1.0 mm，无层间隔，矩阵256×256，层数172层。

1.5图像处理 采用MatLab 7.12(R2011a)dpabi子软件DPARSF 3.2和SPM12 fMRI数据处理软件。将DICOM格式的原始图像转换为NIFTI格式，移除前10个时间点的数据，进行头部运动校正，并将数据以Reslice_112RM-SL_T1模板标准化，重新采样为2 mm×2 mm×2mm的体素元素；然后进行平滑(高斯半高宽3 mm)、非线性漂移和低频滤波处理，频率范围为0.01～0.08 Hz；以Friston24软件去除协变量，包括去趋势线、头部运动参数、脑白质、脑脊液信号等；计算和推导全脑fALFF值，并以MRIcron软件显示建模前后fALFF值差异有统计学意义的脑区，并根据猴脑解剖图和MNI坐标确定差异脑区的具体位置[1]。

1.6统计学分析 采用SPM 12.0软件对建模前后fALFF进行配对t检验，P<0.005(非校正)及簇丛≥5个体素为差异有统计学意义；根据MNI坐标呈现统计学差异的脑区。采用SPSS 19.0统计分析软件对建模前后实验动物体质量进行配对样本t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

对7只恒河猴均成功完成实验，获得fMRI数据。建模前实验动物体质量为(10.79±3.55)kg，酒精暴露诱导期后体质量为(10.64±3.34)kg，差异无统计学意义(t=-0.795，P=0.457)。fMRI前10 min，2只动物的血液酒精浓度分别为0.46、0.49 mg/ml，其余5只动物的血液酒精浓度均<0.01 mg/ml。

与建模前比较，恒河猴酒精暴露诱导期后fALFF值减低的脑区包括左侧额中回、左侧小脑半球和左侧枕下回(簇丛≥5个体素，P均<0.005)，fALFF值增高的脑区包括右侧中央前回、右侧额中回、右侧楔叶、右侧枕中回和右侧小脑蚓部(簇丛≥5个体素，P均<0.005)，见表1、图1。

3 讨论

随着影像学检查设备和软件的不断更新，诸多新的成像方法得到开发、应用。静息态fMRI的出现，使准确描述活体大脑静息状态下复杂的功能结构成为可能[5]。BOLD信号与神经血管及血流动力学机制密切相关，对血管活性物质如酒精非常敏感[6-7]。低频振荡幅度(amplitude of low frequency fluctuations, ALFF)与区域神经活动成正比，而fALFF对脑灰质更具特异性[8]，可准确描述脑区的自发神经活动。研究[9]表明恒河猴与人类具有相似的默认模式网络(default mode network, DMN)，在麻醉状态下仍具有完整的网络连接。本研究采用静息态fMRI BOLD信号fALFF算法对恒河猴慢性酒精暴露诱导期后脑功能活动进行观察。

表1 与建模前比较，恒河猴酒精暴露诱导期后fALFF值差异有统计学意义的脑区

图1 与建模前比较，恒河猴酒精暴露诱导期后fALFF值差异有统计学意义的脑区

酒精对静息态脑功能的影响根据给药方式、给药量、给药后检测时间不同而具有不同的特点。研究[10]表明急性酒精暴露(口服酒精0.65 g/kg体质量，10 min内服下)后30 min，人脑DMN的ALFF、局部一致性(regional homogeneity， ReHo)和功能连接均发生改变，功能连接减弱脑区主要位于左侧大脑半球，提示左侧大脑半球在静息状态下可能对酒精损伤更敏感。本研究中，恒河猴fALFF值减低的脑区均位于左侧半脑，推测慢性酒精暴露早期脑功能抑制脑区与急性酒精暴露相似，均位于左侧半球。本研究中fALFF值增高脑区均位于右脑，且范围较广泛，涉及额叶、枕叶和小脑等，提示慢性酒精暴露早期脑功能激活具有右脑偏侧化特点，可能与左半脑血流量减少、功能减弱，而右半脑血流量优势代偿有关，其确切机制有待于进一步深入研究。急性酒精暴露可特异性抑制小脑区域神经元活动，长期大量酒精暴露的神经病理学改变主要见于小脑和额叶，在青少年和年轻人的不成熟大脑中尤为明显[11]。本研究结果显示，在慢性酒精暴露诱导期后恒河猴出现左侧小脑半球功能活动减低，可能会影响运动控制。

本研究结果显示，恒河猴双侧额叶在慢性酒精暴露诱导期后即出现功能活动改变，左侧减低，右侧增加。额叶皮层参与药物成瘾的神经生物学机制[12]，额叶与情感和需求关系密切，可能是酒精滥用甚至成瘾作用的重要靶点。慢性酒精暴露下，额叶皮层和岛叶皮层中均可观察到α4β2烟碱型乙酰胆碱受体结合显著降低[13]。本研究结果显示，在慢性酒精诱导期动物模型中，虽然酒精摄入量较低，但额叶已经出现多脑区功能活动改变，提示额叶对酒精的敏感性较高。研究[14]表明，在酒精摄入早期，尽管摄入量较低，但其对神经认知功能已产生显著影响，而酒精长期滥用可导致更严重的大脑结构和功能损害。研究[15]表明，在狂饮和酗酒的青少年中，神经结构和活动的改变可能与高塑性神经发育期大量饮酒的神经毒性作用有关。以上研究及本研究结果均提示慢性酒精暴露早期影响额叶脑功能；随着酒精暴露时间的延长，可能会导致更严重的结构和功能损害；额叶为酒精成瘾研究的重要的靶点。长时间酒精暴露下，实验动物模型或人类额叶功能的动态变化有待于继续研究。

枕叶主要负责视觉处理，酒精对视觉处理中枢的影响明显而广泛，楔叶亦参与视觉加工。既往研究[16]表明，酒精会增加视觉网络中自发BOLD信号波动，提示酒精损害视觉刺激的正常激活响应并影响视觉感知。慢性饮酒会影响青春期雄性恒河猴的视空间联想记忆功能[17]。本研究结果显示，在恒河猴酒精暴露诱导期后出现左侧枕叶fALFF值减低、右侧枕叶和楔叶fALFF值增加，提示视觉皮层可能是酒精诱导神经活动改变的重要靶点。

本研究中，恒河猴慢性酒精暴露诱导期后体质量与建模前差异无统计学意义(P=0.457)，表明动物模型的营养和能量供给均衡，模型建立过程中并未因为酒精摄入而导致能量失衡，体现模型的可行性，可以最大限度降低营养供给失衡对实验的干扰。且本研究中，MR检查前10 min，恒河猴体内血液酒精浓度较低，降低了急性酒精暴露对大脑的影响，从而减少对实验结果的干扰。本研究的不足在于样本量较小，数据分析和统计方法较单一，有待增加样本量、改进分析方法等进一步研究。

综上所述，恒河猴慢性酒精暴露诱导期后静息态脑功能活动出现明显改变，表现为左半脑减低，右半脑增强，上述发现为后续建立非人灵长类慢性酒精暴露模型提供了依据，为人类酒精成瘾研究提供参考。