糖尿病大鼠海马MPTP、Ca2+、Bcl-2/Bax的表达及有氧运动和四叶参的干预作用

王冬梅 刘 瑶 王兴通

(泰山医学院运动医学与康复学院，山东 泰安 271016)

糖尿病是一种全身代谢性疾病，发病率逐年上升，引起全世界的高度重视[1]，尤其是II型糖尿病，它会导致机体发生一系列慢性并发症，使患者致残或致死[2]。海马组织对血糖的变化很敏感，糖尿病脑萎缩的主要变化发生在海马组织[3]。神经细胞活动依赖线粒体提供能量，线粒体功能障碍会导致胰岛素抵抗，对线粒体靶点研究可以为糖尿病发病机理及防治提供重要的参考价值。随着全民健身及崇尚自然热潮的兴起，运动及天然保健食品在糖尿病中的作用越来越受到人们的重视。四叶参的块根中富含多糖、生物碱和黄酮等成分，具有清除自由基及抗氧化作用[4]。本实验旨在观察运动和四叶参干预对糖尿病大鼠血糖、海马线粒体通透性转换孔、钙转运及Bcl-2/Bax的影响，阐明其改善糖尿病的海马线粒体机制。

1 材料与方法

1.1 动物

健康雄性Wistar大鼠50只，体重(166±8)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，分笼饲养，自由饮水摄食。动物房内温度(23±2)℃，相对湿度(50±10)%，自然光照交替。

1.2 主要试剂和仪器

链脲佐菌素和偶氮砷为Sigma公司产品，泰山四叶参购自泰山四大名药开发有限公司，血糖试纸为德国罗氏，Bcl-2和Bax抗体为Santa Cruz公司产品，BCA蛋白定量试剂盒购自博士德公司，线粒体提取试剂盒购自Qiagen公司，其它为国产分析纯。紫外分光光度计产自上海分析仪器总厂，双光束紫外分光光度计为天美科技有限公司仪器。配制MPTP测试介质：230 mmol/L甘露醇、70 mmol/L蔗糖和3 mmol/L Hepes(pH7.4)。

1.3 糖尿病模型制备及分组

大鼠适应性喂养1 w后，高糖高脂喂养4 w，30 mg/kg一次性注射链脲佐菌素建立实验性糖尿病大鼠模型。造模成功后分为糖尿病对照组(DM组)、糖尿病运动组(DMT组)、糖尿病中药组(DML组)、糖尿病运动和中药组(DMTL组)，每组6只大鼠，另取6只大鼠作为正常对照组(C组)。

1.4 运动与中药干预方法

采用跑台运动干预，15 m/min，坡度5°，隔日运动，每次60 min，持续8 w。中药干预组大鼠每日灌胃四叶参多糖200 mg/kg，其余组大鼠灌服同体积的生理盐水，持续8 w。

1.5 线粒体提取

10%水合氯醛400 mg/kg麻醉大鼠，断头分离海马，剪碎，500 μl裂解液匀浆，加入1.5 ml裂解液，1000 r/min离心10 min，取沉淀。加入1.5 ml分离液，1000 r/min离心10 min，取上清。6000 r/min离心10 min，弃上清，加入1 ml线粒体保存介质，6000 r/min离心20 min，获得的沉淀即为线粒体。采用BCA法测定线粒体蛋白质。

1.6 MPTP开放检测

根据蛋白定量结果，移取一定量的线粒体到比色皿，MPTP测试介质补足到3 ml，用紫外分光光度计检测520 nm处的吸光度值[5]。

1.7 线粒体Ca2+ 转运检测

在EP管中加入3 ml MPTP测试介质和一定量的线粒体，50 μmol/L AIII作为Ca2+指示剂，室温避光染色45 min，双光束紫外分光光度计检测675～685 nm处的吸光值[6]。

1.8 Bcl-2/Bax蛋白表达检测

每20 mg海马组织碎片加入0.2 ml裂解液，4℃ 12000 r/min离心15 min，取上清，用BCA法测定蛋白含量。浓缩胶80V 20 min，分离胶120V 60 min。将蛋白分子转移到PVDF膜上，加入Bcl-2/Bax一抗，4℃过夜，二抗室温孵育1 h。ECL化学发光法进行检测。

1.9 统计学处理

2 结 果

2.1 血糖水平的检测结果

由表1和图1可知，与C组大鼠相比，DM组大鼠的血糖水平显著升高(P﹤0.01)；与DM组相比，DMT组和DMTL组大鼠的血糖水平显著降低(P﹤0.01)，DML组血糖无显著性变化(P﹥0.05)。

表1 各组大鼠血糖水平比较

注：与C组比较，**P<0.01；与DM组比较，##P<0.01。

与C组比较，**P<0.01；与DM组比较，##P<0.01

2.2 MPTP开放及线粒体Ca2+转运的检测结果

与C组相比，DM组大鼠线粒体吸光度值显著减小(P﹤0.01)，表明MPTP的开放程度显著增加，Ca2+转运量明显增大(P﹤0.01)；与DM组相比，DMT及DMTL组大鼠线粒体的吸光度值显著增大(P﹤0.05)，表明MPTP的开放程度显著减小，Ca2+转运量明显减小(P﹤0.05)。DML与DM组无显著性差异(P﹥0.05)。见表2。

表2 各组大鼠线粒体吸光度值及Ca2+转运量比较

注：与C组比较，**P<0.01；与DM组比较，#P<0.05。

2.3 Bcl-2/Bax蛋白表达结果

与C组比较，DM组大鼠海马Bax蛋白表达显著上调(P﹤0.01)，Bcl-2蛋白表达显著下调(P﹤0.01)，Bcl-2/Bax比值显著减小(P﹤0.01)；与DM组相比，DMT组Bax蛋白表达显著下调(P﹤0.05)，Bcl-2蛋白表达显著上调(P﹤0.01)，Bcl-2/Bax比值显著增大(P﹤0.01)；DMTL组与DM组相比，Bax蛋白表达显著下调(P﹤0.01)，Bcl-2蛋白表达显著上调(P﹤0.01)，Bcl-2/Bax比值显著增大(P﹤0.01)；DML组与DM组相比Bcl-2/Bax比值增大(P﹤0.05)，但两蛋白表达均无显著性差异(P﹥0.05)。见表3和图2～4。

表3 各组大鼠海马Bcl-2及Bax蛋白表达比较

注：与C组比较，**P<0.01；与DM组比较，#P<0.05，##P<0.01。

图2 免疫印迹结果

图3 Bcl-2和Bax灰度值

与C组比较，**P<0.01；与DM组比较，#P<0.05，##P<0.01

图4 Bcl-2和Bax灰度值的比值

3 讨 论

研究表明，高血糖容易引起海马神经元凋亡[3]，线粒体功能障碍和钙稳态的改变与细胞凋亡及糖尿病的发病有密切关系[7]。本研究试图寻求糖尿病发生的中枢机制及新的药物作用靶点，从调节生活方式的角度积极寻求改善糖尿病的有效方法。

线粒体通透性转换孔(MPTP)是一种多蛋白复合体，位于线粒体内外膜交界处，介导物质转运，其高水平开放在细胞凋亡的诱导过程中起着决定性作用[8]。本实验结果显示，糖尿病大鼠海马MPTP开放程度显著增大，表明MPTP的开放可能是糖尿病发病的机制之一。运动或运动与四叶参相结合的方法均能降低MPTP的开放，降低血糖水平，提示运动或运动与中药组联合能够改善糖尿病症状，此功能与其降低MPTP的开放相关。实验也表明，单纯8周的四叶参干预有改善MPTP开放和血糖水平的倾向，但没有显著性变化，推测可能8周四叶参干预的时间并不足以引起显著性变化，饮食干预或许需要长期坚持才能取得明显效果。

Bcl-2家族蛋白对MPTP的开放程度起着关键的调节作用。促凋亡蛋白Bax介导MPTP的开放，而抑凋亡蛋白Bcl-2则通过抑制MPTP的开放，发挥抑凋亡的作用[9]，细胞凋亡取决于Bcl-2/Bax比值。本实验发现糖尿病大鼠Bcl-2表达下调，Bax表达上调；运动或运动与四叶参联合干预后，Bcl-2表达上调，Bax表达下调，表明运动或运动与中药干预降低血糖的作用机制可能和Bcl-2/Bax调节MPTP的开放有关。

线粒体是细胞内Ca2+调节的重要细胞器，线粒体内Ca2+聚积可导致MPTP长时间开放，从而又会介导线粒体的Ca2+释放，细胞内Ca2+稳态失衡能启动细胞凋亡的信号转导[10]。本研究中，吸光值下降表明测试系统内的Ca2+浓度降低，线粒体摄取Ca2+；吸光值上升表明测试系统内Ca2+浓度升高，线粒体外排Ca2+。研究发现，糖尿病大鼠海马组织线粒体Ca2+转运量显著增加，而运动及运动联合补充四叶参能够降低Ca2+转运量，表明运动及运动联合饮食干预降血糖的机制与MPTP开放及Ca2+转运有关，提示降低MPTP的大量开放，减少Ca2+转运对糖尿病的改善有重要意义。

综上所述，实验结果表明，运动或运动与饮食干预对糖尿病大鼠血糖的改善有显著效果，其可能机制与细胞Bcl-2/Bax升高所致MPTP开放下调及Ca2+转运降低有密切的关系。本实验为糖尿病的防治提供了一定的理论基础，需要深入加以研究。