LRPPRC siRNA对前列腺癌细胞比卡鲁胺敏感性的影响

张鸿毅 赵刚刚 李华锋 肖克兵 崔洁

西安医学院第一附属医院1泌尿外科，2肿瘤科（西安710077）；3西安医学院全科医学院（西安 710077）

前列腺癌是一种雄激素依赖性肿瘤，肿瘤的生长和转移主要通过雄激素信号途径来进行。雄激素阻断是前列腺癌的主要治疗方法之一。虽然大部分患者对初始治疗敏感，但遗憾的是，在18～24个月以后却出现雄激素抵抗和生化复发［1-3］。因此，提高前列腺癌对内分泌治疗的敏感性是一项重要的研究课题。富含亮氨酸的三角状五肽重复结构蛋白（leucine rich pentatricopeptide repeat containing，LRPPRC）是一种线粒体蛋白，在维持氧化磷酸化活性中发挥重要作用［4-6］。我们的前期研究发现，下调LRPPRC促进前列腺癌细胞线粒体凋亡，本课题在体外水平进一步研究下调LRPPRC是否可以增强前列腺癌细胞对雄激素阻断治疗的敏感性，探讨LRPPRC是否可以成为一个分子靶标，克服雄激素抵抗。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株人前列腺癌细胞株LNCaP和DU145均购于中科院上海生命科学研究院细胞中心。10%FBS的RPMI 1640培养基，37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱培养。

1.1.2 主要试剂RPMI 1640培养基购自赛默飞世尔生物化学制品有限公司；胰蛋白酶购自上海亨代劳商贸有限公司；四甲基偶氮唑盐购自美国Sigma公司；细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天生物技术研究所；SDS-PAGE凝胶配置试剂盒购自北京华肽先锋生物科技有限公司；逆转录试剂盒购自日本Takara公司；Caspase-3小鼠抗人单克隆抗体、Bcl-2兔抗人单克隆抗体、Bax兔抗人单克隆抗体均购自美国Abcam公司；LRPPRC兔抗人单克隆抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司。

1.2 试验方法

1.2.1 siRNA转染实验取对数生长期细胞，提前1 d将细胞铺在6孔板中，调整细胞密度为30%～50%/孔，每孔约0.4×106个细胞。配置转染试剂，10 μL OligofectaminTM、10 μL LRPPRC siRNA（10 μmol/L）与80 μL RPMI 1640培养基混合。在每孔加入已配置好的转染试剂。48 h完成转染。LRPPRC siRNA靶序列见表1。

表1 LRPPRC siRNA靶序列Tab.1 Sequences of LRPPRC siRNA

1.2.2 MTT法取对数生长期细胞，胰酶消化细胞，调整细胞悬液浓度，使细胞密度为5 000个/孔，待细胞贴壁后进行药物干预，24 h终止培养，加入MTT，继续培养4 h，弃上清，加入DMSO，避光条件下震荡10 min，在酶联免疫检测仪上检测OD490 nm吸光值，计算细胞存活率，实验重复3次。

1.2.3 流式细胞术检测凋亡将对数生长期细胞接种于六孔板，待细胞贴壁后进行药物干预，24 h终止培养，胰酶消化、收集细胞，调整细胞悬液浓度为（0.5～1）×106/mL，PBS洗2遍，分别加入AnnexinV-FIT、PI和Binding Buffer，在室温下避光反应15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡率，重复实验3次。

1.2.4 Western blot检验首先提取细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度，制作SDS-PAGE凝胶，蛋白电泳、转膜，滴加一抗，4℃孵育过夜，室温下二抗孵育1 h，ECL化学发光反应，Quantity One 4.62凝胶图像扫描，试验重复3次。

1.3 统计学方法采用SPSS 19.0进行统计学分析，两组间均数比较采用t检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 下调LRPPRC显著增强LNCaP细胞对比卡鲁胺的敏感性在LNCaP和DU145中转染siRNA LRPPRC，48 h后药物干预。分为4个处理组，包括对照组、比卡鲁胺组、siRNA LRPPRC组和比卡鲁胺+siRNA LRPPRC组。比卡鲁胺设置10、50和100 μmol/L 3种剂量。24 h干预结束，终止培养。MTT法检测各组细胞存活率。结果显示，比卡鲁胺显著抑制LNCaP细胞增殖，药物浓度增高和处理时间延长，细胞存活率显著降低（P＜0.05），对DU145细胞增殖无显著抑制作用（图1）。与对照组、比卡鲁胺组、siRNA LRPPRC组比较，比卡鲁胺（50 μmol/L或100 μmol/L+siRNA LRPPRC显著抑制LNCaP细胞增殖。在DU145中未观察到下调LRPPRC对比卡鲁胺的显著增敏作用（图2）。

图1 比卡鲁胺对前列腺细胞增殖抑制作用Fig.1 The anti-proliferation effect of bicalutamide in prostate cancer cells

图2 不同处理组对前列腺癌细胞的增殖抑制作用Fig.2 The anti-proliferation effects of different treatments in prostate cancer cells

2.2 下调LRPPRC显著增强比卡鲁胺诱导的LNCaP细胞凋亡流式细胞术检测前列腺癌细胞凋亡率。结果显示：在LNCaP细胞中，50 μmol/L比卡鲁胺+siRNA LRPPRC组细胞凋亡率显著增高（27.9%）（P ＜ 0.05），10 μmol/L比卡鲁胺+siRNA LRPPRC组的凋亡率（7.3%）与siRNA LRPPRC组（6.9%）比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。在DU145细胞中未观察到下调LRPPRC增强比卡鲁胺诱导的凋亡。说明下调LRPPRC促进高剂量比卡鲁胺诱导的激素敏感性前列腺癌细胞凋亡（图3）。

图3 前列腺癌细胞不同处理组凋亡率Fig.3 The apoptosis rates of prostate cancer cells with different treatments

2.3 LRPPRC对前列腺癌细胞凋亡相关蛋白表达的影响Western blot法检测前列腺癌细胞凋亡相关蛋白的表达。比卡鲁胺+siRNA LRPPRC组pro-Caspase-3表达降低，cleaved Caspase-3表达增高，Caspase-3活化水平增高。比卡鲁胺增强LNCaP细胞Bcl-2蛋白表达，下调LRPPRC降低被比卡鲁胺增强的Bcl-2蛋白表达（图4）。与siRNA LRPPRC组比较，DU145细胞比卡鲁胺+siRNA LRPPRC组Caspase-3活化水平无明显增强，比卡鲁胺对DU145细胞Bcl-2和Bax蛋白表达无明显影响（图5、6）。

3 讨论

癌细胞通过调节线粒体功能适应各种压力，使细胞产生凋亡抵抗，从而对抗肿瘤药物耐受。目前研究发现Bcl-2蛋白家族介导的线粒体凋亡异常是癌细胞对凋亡抵抗的原因之一［7-8］。

LRPPRC是调节线粒体氧化磷酸化活性的重要蛋白。近期研究［9-12］发现在多种类型的肿瘤组织中LRPPRC呈高表达状态，而在周围正常组织中几乎不表达。笔者的前期研究发现前列腺癌组织LRPPRC高表达，LRPPRC和Bcl-2表达有显著正相关性［13］，LRPPRC可能通过调节Bcl-2表达，影响前列腺癌细胞线粒体凋亡［14］。本研究进一步探讨了LRPPRC对雄激素受体拮抗剂敏感性的影响。结果发现，在激素依赖性前列腺癌细胞中，下调LRPPRC使比卡鲁胺的增殖抑制和凋亡诱导作用增强，并且这种作用是与剂量有关的，即对50 μmol/L比卡鲁胺有增敏作用，而对10 μmol/L无显著增敏作用。既往研究发现比卡鲁胺通过增强Bcl-2蛋白的表达获得凋亡抵抗，而对比卡鲁胺耐药［15］。本研究发现比卡鲁胺使Bcl-2表达增高，下调LRPPRC降低被比卡鲁胺增强的Bcl-2表达。在激素抵抗性前列腺癌细胞中，我们未发现下调LRPPRC对比卡鲁胺的增敏作用，进一步研究发现比卡鲁胺对DU145细胞Bcl-2/Bax蛋白表达无显著影响，而LRPPRC对凋亡的影响是通过调节Bcl-2水平实现的，因此我们认为，下调LRPPRC可能通过抑制被比卡鲁胺增强的Bcl-2表达来增敏比卡鲁胺。

图4 LNCaP细胞不同处理组Caspase-3、Bcl-2、Bax蛋白表达Fig.4 The Caspase-3，Bcl-2，Bax protein expressions in LNCaP cells with different treatments

图5 DU145细胞不同处理组Caspase-3蛋白表达Fig.5 The Caspase-3 protein expressions in DU145 cells with different treatments

图6 比卡鲁胺对DU145细胞Bcl-2/Bax蛋白表达的影响Fig.6 The Bcl-2/Bax protein expressions in DU145 cells with bicalutamide

诱导癌细胞凋亡一直是肿瘤治疗领域的重要方向［16］。雄激素受体拮抗剂通过诱导凋亡抑制前列腺癌生长。但是，癌细胞在低雄激素信号的微环境中，会逐渐产生凋亡抵抗。癌细胞通过上调抗凋亡蛋白逃离药物诱导的凋亡。抑制LRPPRC表达使抗凋亡蛋白Bcl-2水平降低，癌细胞对雄激素受体拮抗剂的敏感性增强。因此，LRPPRC可能成为一个分子靶标，增强激素依赖性前列腺癌对雄激素受体拮抗剂的敏感性，降低耐药克隆出现的机率，延缓生化复发时间，改善预后。但当肿瘤进展为激素抵抗时，抑制LRPPRC表达对雄激素受体拮抗剂无增敏作用。因此，在临床上联合应用雄激素受体拮抗剂和针对LRPPRC的分子靶向药物时，要选择合适的获益人群。