热休克诱导细鳞鲑三倍体的初步研究

陈春山，魏 凯,韩姝伊，郑 伟，郭明磊，董 颖，胡红霞

(1.北京市水生野生动植物救护中心，北京102100；2.中国科学院动物研究所，北京100101；3.河北师范大学，石家庄050024；4.吉林省延边自治州水产站，吉林延吉133001；5.北京市水产科学研究所，北京100068)

鱼类染色体组操作是遗传育种工作的重点研究领域之一。在多倍体鱼中，三倍体鱼因染色体组成不平衡，性腺不能发育成熟，避免了性腺发育时期生长停滞和鱼肉质量下降等不利影响，对控制过度繁殖、增加生长速率、延长成熟鱼的寿命以及提高养殖产量和鱼肉质量具有重要的意义[1-3]，也是鱼类育种方面研究的热点之一。国内外在鱼类三倍体育种方面已成功诱导出斑马鱼(Brachydaniorerio)[4]、黑鲷(Sparusmacrocephlus)[5]、牙鲆(Paralichthysolivaceus)[6]等40多种鱼类。三倍体湘云鲫(Triploid Crucian Carp)[7]、兴国红鲤(Cyprinuscarpiovarsinguonensis)[8]已进入实用化生产阶段。

细鳞鲑(Brachymystaxlenok)是我国名贵的鲑科冷水性鱼类，具有重要的经济价值[9]。由于环境变化和人类活动干扰等原因，细鳞鲑的自然资源量急剧下降，分布区域缩小。近年来，细鳞鲑的资源保护和人工增殖受到高度重视，很多学者对其主要分布水域的生物学特性和繁殖生态学进行了调查研究[10]，细鳞鲑全人工繁殖研究也取得成功[11-13]。但由于细鳞鲑幼鱼生长速度较慢，繁殖后亲鱼死亡率较高，特别是雄性亲鱼产后死亡率最高可达80%以上，影响了规模化生产。为更好地解决细鳞鲑在推广过程中的瓶颈，根据三倍体鱼具有不育、个体大、生长快、寿命长、成活率高等优良品性，本研究参考了虹鳟[14](Oncorhynchusmykiss)、金鳟[15](OncorhynchusmykissWalbaum)、硬头鳟[16](Oncorhynchusmykiss) 、大西洋鲑[17](Salmosalar)等鲑科鱼类三倍体诱导结果，采用热休克法进行了细鳞鲑三倍体诱导技术实验，探讨细鳞鲑三倍体鱼诱导的可能性，为进一步开展三倍体与二倍体对比实验和规模化生产三倍体苗种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验用鱼与养殖管理

实验用亲鱼采自吉林省珲春细鳞鲑水产良种场，年龄为5+龄，规格为(1 500±125)g(♀)，(1 100±89)g(♂)。其中，雌性亲鱼27尾，共采卵118 395粒。细鳞鲑三倍体诱导实验及受精卵的孵化在珲春细鳞鲑水产良种场养殖车间进行，后期将部分实验鱼苗运至北京市水生野生动植物救护中心养殖基地进行饲养管理。每个养殖水槽放置1 000尾鱼苗，养殖用水为曝气后的地下水，溶氧>8 mg/L，pH 8.0～8.4，每天投喂5次，日投喂量按照体重的5%～7%计算，每天上午10点和下午4点吸污一次，养殖150 d后进行倍性检测。

1.2 受精与孵化

选择性腺发育成熟的细鳞鲑。雄性身体瘦长，体两侧和腹部颜色发黑，有暗红色斑纹，生殖孔凹陷，后期轻压腹部有少量乳白色精液流出；雌性体型丰满，腹部圆润，体两侧和腹部白色，无红色斑纹，后期生殖孔红肿外凸。选择发育良好，副性征明显，规格整齐，体表无伤的亲鱼催产，催产药物LHRH-A2和DOM组合(宁波第二激素厂)，剂量为雌鱼2.5 μg/kg LHRH-A2+2.5 mg/kg DOM，雄鱼减半，一次性注射。干法受精获得受精卵。水源为山泉水，受精水温8.7 ℃，孵化水温为7.6-12 ℃，平均10.25 ℃。采卵与孵化具体方法参照陈春山等[13]方法进行，其中受精卵达到160 ℃·d开始发眼，达到260 ℃·d开始破膜(图1)。

图1 细鳞鲑发眼卵Fig.1 Eyed eggs of Brachymystax lenok

1.3 三倍体诱导

参考虹鳟等鲑科鱼类三倍体最佳诱导条件，实验共分为6组，设计了24、26、28 ℃三个诱导温度。重点进行了26 ℃的诱导实验，包括15、20 min二个起始诱导时间，10、20 min二个持续诱导时间。24 ℃和28 ℃仅选择最优处理条件进行比较。每组设3个重复，设一个对照组。实验参数见表1。

表1 热休克诱导细鳞鲑三倍体实验参数Tab.1 Experiment parameters of heat shock induced triploid of B.lenok

热休克处理在电子恒温水浴锅中进行，水温误差≤0.5 ℃，灵敏度0.1 ℃。将受精卵放于直径15 cm的不锈钢漏网中，先在水温20 ℃的水浴锅中过渡1 min，再放入设定处理水温的水浴锅中，轻轻晃动漏网，使受精卵尽快与周围水温相一致。热处理后受精卵直接放入8.7 ℃孵化水温的容器中，处理后2～4 h期间检出死卵，放入桶中孵化。对照组受精后2～4 h期间挑出死卵直接放入孵化桶孵化。

1.4 倍性检测

采用 Pactec CyFlow Cube 8 型流式细胞仪检测鱼苗血液 DNA 相对含量的方法确定三倍体率。鱼苗培育至(5.86±0.99)cm，试验组每组随机采样30尾，断尾抽血，每次检测 3 尾二倍体鱼苗作为对照，上述实验在北京市水产科学研究所进行。综合评分[6]按三倍体率和发眼率之和为100%，三倍体率占40%，发眼率占60%。若三倍体率与发眼率中有一项为零，则综合评分为零。

1.5 数据分析

受精卵热处理后2～4 h期间挑出死卵，计算死亡率。孵化发眼后挑出未发眼卵，统计发眼率。孵化后检出未出膜卵，统计孵化率。

试验数据采用Excel软件进行整理，再用SPSS 13.0对数据进行方差分析，其中，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 诱导时间对实验结果的影响

卵子受精后15、20 min，热处理10、20 min均可诱导出细鳞鲑三倍体鱼，各实验组间发眼率、孵化率、4 h死亡率、三倍体率差异显著(表2)。在处理温度相同(26 ℃)，持续处理时间都是10 min条件下(2组和4组)，起始受精时间不同(15 min和20 min)，4 h死亡率和孵化率无显著差异(P>0.05)，发眼率和三倍体率有显著差异，起始处理时间20 min组高于15 min组。在处理温度相同(26 ℃)，持续处理时间都是20 min条件下(3组和5组)，起始受精时间不同(15 min和20 min)，4 h死亡率、发眼率、孵化率和三倍体率均存在显著差异(P<0.05)，起始处理时间20 min组高于15 min组。在处理温度(26 ℃)相同，起始受精时间(15 min或20 min)相同，持续处理时间(10 min和20 min)不同，4 h死亡率、发眼率、孵化率、三倍体率存在显著差异(P<0.05)。与二倍体的对照组相比，各实验组4 h死亡率显著高于对照组，孵化率显著低于对照组，发眼率除5组外也与对照组差异显著。

2.2 诱导温度对实验结果的影响

24、26、28 ℃三个处理温度均可获得三倍体鱼(表2)。受精卵经不同温度热休克处理后，各实验组4 h死亡率差异较大，都与对照组差异极显著。死亡率最高的是28 ℃组达(21.76±0.12)%，其次是24 ℃组达(12.57±0.24)%，最低是26 ℃组[(4.71±0.15)%～(8.31±0.64)%]，2组和4组无显著差异。经过热处理后的4 h死亡率明显高于对照组的死亡率，表明热休克处理对细鳞鲑受精卵的影响比较大。

6个实验组发眼率均较高(78.18±0.23)%～(92.62±0.74)%，除5组和对照组组间无显著差异外，各实验组间及与对照组差异均极显著。处理温度对孵化率影响差异较大，第6组孵化率最低(25.63±0.17)%，1～5组都在82%以上，都与对照组差异显著。

表2 热休克诱导细鳞鲑三倍体实验结果Tab.2 Experiment results of triploid induction by heat shock

注：a,b,c,d,e,f：同列中不同上标字母表示各组间差异显著(P<0.05)。

2.3 细鳞鲑DNA含量及三倍体诱导率

经流式细胞仪检测分析结果显示，二倍体细鳞鲑的DNA相对含量为50左右(见图2)，三倍体细鳞鲑的DNA相对含量为75左右(见图3)，图4为二倍体与三倍体血液混合后测定的DNA相对含量结果。6个实验组间三倍体率差异显著(见表2)，最低为24℃实验组的48.25%；最高为26℃、起始受精时间为20 min、持续处理时间为20 min实验组的95.45%。综合评分结果表明第5组为最佳诱导条件(见表3)。

图2 二倍体细鳞鲑DNA含量Fig.2 DNA content of diploid B.lenok

图3 三倍体细鳞鲑DNA含量Fig.3 DNA content of triploid B.lenok

3 讨论

3.1 诱导起始时间与持续时间的确定

根据鱼类受精细胞学的研究，抑制第二极体的排放可以使染色体加倍形成三倍体受精卵,因此，对诱导时间的把握尤为重要。不同鱼类第二极体的排放时间不同，国内养殖较多的经济鱼类，如草鱼、白鲢、锦鲤等第二极体的排放大多在受精后3～8 min[18-20]，而冷水性鱼类较迟缓，如鲑科鱼类第二极体的排放大多在受精后15～40 min[21-23]。在这个时间用热休克法处理，是获得染色体加倍的最佳时机。张艳萍等[24]认为，虹鳟受精卵发育至15 min时，是热休克处理的敏感期，在此期间第二极体已经形成但尚未排出细胞外，是获得三倍体的最佳时期，其中处理持续时间为主要影响因素。吴玉萍等[4]分析了热休克处理斑马鱼的参数与三倍体出现率和胚胎相对存活率的关系，认为诱导参数中起始诱导时间为重要因素，其次为持续时间和诱导温度。在本实验条件下，细鳞鲑在受精后15 min、20 min通过热休克处理都能获得三倍体，表明细细鳞鲑卵子的热敏感期较长，阈值较大。同种鱼类由于卵的成熟度差异和受精水温不同，受精卵的胚胎发育快慢程度也不同，因此选择起始诱导时间应考虑受精时水温的因素。

图4 二倍体和三倍体细鳞鲑DNA相对含量Fig.4 Relative DNA content of diploid and triploid B.lenok

组别发眼率/%三倍体率/%评分结果184.1948.2569.81278.1868.5374.32389.7390.0689.86485.8374.1781.17592.6295.4593.75679.2257.6270.58对照93.0800

此外，在温度休克试验中另外一项重要因素是诱导持续时间的确定。楼允东[25]认为温度休克诱导三倍体技术中，随着持续时间的增加(在一定的处理时间范围内)，诱导率也在增加。宋立民等[26]研究发现三倍体的产生需要一个适度的外界刺激以阻止第二极体的释放。刺激强度太小，不能够阻止大多数卵子染色体组的迁移，只能产生少量三倍体。刺激强度过大，则会使染色体断裂或丢失，形成非整倍体，胚胎受到损害，存活率大大降低。本实验条件下持续处理10 min和20 min，均可获得细鳞鲑三倍体鱼，在其他条件相同情况下，处理20 min三倍体率和发眼率高于处理10 min的三倍体率和发眼率。由此我们认为10～20 min属于正常的刺激强度范围，且诱导率与持续时间呈正相关。下一步，我们将着重探讨影响细鳞鲑受精卵存活的持续时间上限阈值。

3.2 诱导温度的确定

王炳谦等[14]采用热休克诱导全雌虹鳟鱼三倍体，受精卵经26 ℃处理的诱导效果好于24 ℃和28 ℃的，与本实验结果相同。在26.5 ℃水温、受精后20 min，28 ℃处理20 min，三倍体率13.33%，4 h死亡率39.59%，发眼率19.1%，孵化率2.59%。同样的时间条件下，采用26 ℃处理，获得三倍体率86.67%，4 h死亡率18.21%，发眼率71.65%，孵化率64.62%。张艳萍等[24]采用三个不同温度(26.5、28、30 ℃)进行虹鳟三倍体诱导处理，均成功产生虹鳟三倍体，随着诱导温度的升高、处理持续时间的延长，虹鳟受精卵2 h内死亡率逐渐上升；在30 ℃处理持续时间超过10 min的条件下，虹鳟受精卵全部死亡或停止发育，认为30 ℃临近虹鳟发眼卵的致死温度。Dube等[23]用22、24、26 ℃热刺激美洲红点鲑产生的三倍体率极低(0～20%)，27～33 ℃最高可获得100%的三倍体率，但存活率差异很大。

结合国内学者对虹鳟及其它鲑科鱼类进行热休克诱导的研究结果，适宜的处理温度是保证细鳞鲑三倍体诱导成功的重要前提，而最佳诱导温度可能在26 ℃左右，且随着温度的升高，受精卵的成活率会降低。因此，我们重点进行了26 ℃组的实验分析，同时选择24℃和28℃时诱导率较好的处理条件进行比较。结果显示，24、26、28 ℃三个处理温度均可获得三倍体细鳞鲑个体，但三倍体率差异显著。在此基础上，对2～4 h死亡率、发眼率、孵化率几个因素进行比较，发现各组存在显著差异。其中，温度对2～4 h死亡率影响最明显，28 ℃组死亡率最高，其次是24 ℃组，26 ℃组最低。温度对发眼率影响较小，对孵化率有一定影响。因此，诱导温度是影响本实验结果的关键因素。26 ℃处理结果好于24 ℃和28 ℃，该结果与实验设计预期结果相同。

3.3 热休克诱导细鳞鲑的最佳条件

本试验按照Gervai等[27]评分标准，初步确定细鳞鲑热休克诱导三倍体的最佳条件是受精后20 min，26 ℃处理20 min，与虹鳟[14]、金鳟[15]诱导最佳条件接近。与其它鱼类的研究成果对比，Xu等[28]采用冷休克法诱导牙鲆三倍体，三倍体率高达100%，且最高成活率为93.27%；张艳萍等[24]实验结果，在26.5 ℃下，受精后15 min起始处理10 min，诱导虹鳟三倍体效果最佳，发眼率为79.32%，诱导率达到83.18%。上述不同鱼类温度休克敏感性的差异不仅与遗传背景有关，还与卵子成熟度有关。一般来讲，动物的遗传背景及卵子的成熟度使得不同动物甚至同一动物在不同试验环境的最佳诱导条件都会发生变化。