HDAC4基因甲基化对hMSCs向汗腺样细胞诱导转分化的影响*

赵换军， 丁 路， 付潇潇， 王慧英, 张翠萍

(1. 首都医科大学附属北京潞河医院， 北京 101100； 2. 解放军总医院第一附属医院全军创伤修复与组织再生重点实验室， 北京 100048)

在大面积深度烧伤患者中，皮肤的附属器官——汗腺的缺失是烧伤后面临的重大难题。目前，汗腺再生方式主要有自体移植和干细胞转分化，鉴于自体移植受供区来源的限制，通过干细胞转分化为“汗腺样”细胞，便成为十分有应用前景的来源[1]。基于本实验室的研究基础，选用人骨髓间充质干细胞(hMSCs)作为种子来源，探讨转分化过程中的调节机制[2]。作为表观遗传学重要的修饰形式，DNA甲基化对干细胞分化的调控作用已得到广泛认知[3]。目前，国内外关于hMSCs转分化为汗腺样细胞过程中DNA甲基化作用的研究尚未见报道。本研究旨在探讨hMSCs转分化为汗腺样细胞过程中，DNA甲基化的改变及组蛋白去乙酰化酶4 (HDAC4)基因甲基化对于转分化的调控作用。

1 材料与方法

1.1 试剂与设备

人骨髓间充质干细胞 (HUXMA-01001) 购自Cyagen公司；Dulbecco's改良Eagle培养基(DMEM)和胎牛血清均购于Gibco公司，DNA Methylation-GoldTMKit购自Zymo公司，Quick-g DNA提取试剂盒购自Promega公司，PCR扩增仪 (美国Bio-Rad)，Transwell购自美国Corning公司，诱导培养基由本实验室自行配置。

1.2 hMSCs诱导分化体系的建立

将取自健康志愿者的人皮肤汗腺细胞置于Transwell六孔板的下室中，待汗腺细胞贴壁并生长融合至70%～80%时，放入47℃环境中40 min，造成汗腺细胞热休克模型。在下室的经热休克处理后的汗腺细胞及上室的hMSCs[(1～2)×105cells)]中，分别加入诱导培养基(即在汗腺培养基中加入1 μg/ml EGF、50 ng/ml rhEDA-A1)和DMEM专用培养基(Gibco)，在37℃、含5%CO2、饱和湿度的环境下建立共培养体系培养，同时设置平行对照 (未共培养的hMSCs)。共培养10 d后，对细胞表型等进行鉴定。

1.3 HDAC4甲基化水平变化的检测

亚硫酸钠修饰DNA及MSP引物设计。hMSCs共培养10 d后，用Quick-g DNA试剂盒分别提取对照组及共培养组细胞DNA，采用EZ DNA Methylation-GoldTM Kit，按操作手册进行亚硫酸氢钠的转化。随后在http://www.urogene.org/methprimer/上，设计HDAC4的MSP引物[(分别针对未甲基化(U)和甲基化(M)的引物)]，并对HDAC4基因启动子区CpG岛甲基化水平进行Mass Array验证。MSP引物信息具体如表1。

Tab. 1 Primer information

1.4 5-aza-CdR的干预及RT-PCR检测mRNA表达

取对数生长期的hMSCs，以2×105cells/well接种于6孔板中，培养24 h。待细胞融合至约70%～80%时，实验组加入甲基转移酶抑制剂5-氮-2-脱氧胞苷(5-aza-2-deoxycytidine，5-aza-CdR，Sigma)，终浓度为10 μmol/L，对照组中加入等体积PBS。继续培养48 h后收集细胞，用于检测mRNA表达。以Trizol法提取两组细胞的RNA，使用分光光度仪进行定量与纯度测定(A260nm:A280nm)，琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。随后用一步法试剂盒进行反转录与PCR扩增，产物作琼脂糖凝胶电泳，使用Bio-Rad凝胶成像仪观察HDAC4 mRNA和CEAmRNA水平的变化。所用引物序列由上海生物工程有限公司合成，每个实验重复3次。

1.5 统计软件分析

2 结果

2.1 hMSCs及转分化后汗腺样SGLCs细胞

在倒置相差显微镜下观察共培养前选取的P3代hMSCs，细胞呈纺锤状，细胞大小均一性良好(图1A)；人外分泌汗腺细胞呈环状单层细胞，多呈扁平、不规则的多边形(图1B)；经共培养10 d诱导分化后的细胞形态呈多样化，出现近似于汗腺样细胞的改变，由诱导前的长梭形变为扁平不规则形态，并且逐步聚集呈向心性生长(图1C)。

Fig.1The changesof morphology in the different cells (uncoulored ×100)

A: P3ofhuman mesenchymal stem cells; B: Sweat gland cells; C: Transdifferentiationcells like sweat gland cells

2.2 HDAC4基因甲基化改变的分析

分别提取细胞转分化前后的RNA，并作琼脂糖凝胶电泳，电泳结果显示产物为单一、特异的明亮条带，扩增效率良好。随后，通过MethPrimer设计HDAC4基因的MSP引物(图2A)，并截取HDAC4基因启动子区CpG岛3个，分别为Island1(679-867)，Island2 (905-1591)和Island3 (1604-1943)，对Island2进行取样检查，探针cg2463009处CpG位点甲基化程度为0.901，转化后细胞中HDAC4基因对应位点甲基化程度为0.531，与诱导分化前hMSCs相比差异有统计学意义(P<0.05)；探针cg14823429处CpG位点甲基化程度为0.687，细胞转分化后HDAC4基因对应位点甲基化水平降低，由诱导前的0.687下降到0.386，Beta-difference大于0.2，与诱导分化前hMSCs相比差异有统计学意义(P<0.05，图2B)。上述结果均显示诱导前细胞HDAC4基因甲基化处于高水平。

A：The primer of the histone deacetylases 4gene in MSP；B：The change of histone deacetylases 4gene in the Island2 by Mass Array

2.3 5-aza-CdR干预后HDAC4基因及CEA基因mRNA表达情况

使用5-aza-CdR(10 μmol/L)处理后，hMSCs平均甲基化水平下调，随之HDAC4基因mRNA表达水平明显升高，与未处理的hMSCs相比，差异有统计学意义(P<0.05，图3)；同时还选取了汗腺相关基因CEA，通过PCR观察发现经5-aza-CdR处理后，CEA基因表达量明显升高，与实验前比较变化明显，具有统计学差异(P<0.05，图3)。

Fig.3Changes of HDAC4 gene expression before and after 5-aza-CdR treatment

3 讨论

DNA甲基化参与干细胞命运的抉择过程得到广泛的认可，而且干细胞分化的过程与特定因子的甲基化模式密切相关也已得到证实[4]。Berdasco等[5]的研究发现，DNA甲基化参与多种成体干细胞分化的调控。

组蛋白去乙酰化酶(HDACs)主要可分为Ⅰ类，Ⅱ类和Ⅲ类。其中，Ⅱ类可进一步分为IIa (HDAC4，HDAC5，HDAC7，HDAC9)和IIb (HDAC6，HDAC10)。与其他HDACs不同的是，HDAC4通过对基因表达的转录控制，广泛参与细胞分化的调控过程[6]，并通过与特定转录因子的作用促进HDAC进入细胞核参与转录过程[7]。本研究使用甲基化特异性PCR对HDAC4基因的甲基化水平进行了检测，结果显示诱导前hMSCs中HDAC4基因甲基化水平较高，诱导转分化后汗腺样细胞中HDAC4基因整体甲基化水平明显下降。用5-aza-CdR处理实验组hMSCs后，发现HDAC4基因检测区域的平均DNA甲基化水平亦呈整体下调状态；可能是基于5-aza-CdR有广泛去甲基化的影响[8]。

基于此，本研究采用飞行质谱方法对HDAC4基因关键调控区域进行了检测。结果发现，在检测HDAC4基因启动子区域中，部分CpG位点处于高甲基化状态；且随着使用去甲基化试剂5-aza-CdR对HDAC4基因甲基化进行干预，发现实验组HDAC4相关基因表达明显上调[9]。与之相对应的是，RT-PCR检测显示，经5-aza-CdR处理后，诱导转分化细胞中HDAC4基因和CEA(CEA为常用的汗腺表面标志物)基因的mRNA表达水平升高，说明在诱导细胞整体甲基化水平降低的过程中，可能存在因HDAC4基因甲基化下降而上调CEA表达，最终呈现促进诱导转分化进程的效果。也可能通过改变HDAC4基因的甲基化，影响诱导转分化相关基因表达的调控，进而影响hMSCs转分化过程[10-11]。

综上所述，本研究发现在hMSCs向汗腺样细胞转分化的过程中，HDAC4基因的甲基化水平明显降低，与此同时CEA基因表达水平有很大提高，很可能是通过CEA基因选择性的入核转录促进转分化的进程。HDAC4基因的甲基化水平下降后导致的染色体构象的改变以及具体调节机制尚待进一步研究。在诱导转分化过程中，伴随着甲基化水平的改变而存在的表观修饰的其他作用形式，比如miRNA对转分化的影响还有待于更进一步的研究。