miRNA-34 a及XIAP在不同基因分型乳腺癌中的表达及意义

王振威，肖刚，刘威，赵永魁，李小江

1唐山市妇幼保健院普通外科，河北 唐山063000

2华北理工大学附属医院普通外科，河北 唐山063000

3迁安市人民医院普外一科，河北 唐山0644000

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，占女性新发肿瘤的29%，其发病率逐渐年轻化，是20～59岁女性癌症死亡的主要原因之一，严重影响妇女身心健康甚至危及生命[1]。放疗、化疗和手术治疗是乳腺癌患者最常见的治疗方法。传统的化疗、放疗方法可以缓解疾病的恶化，但在乳腺癌治疗中有较大的不良反应，且治疗效果有限[2]。研究表明，致癌作用的分子机制不仅与蛋白质编码基因有关，且与非编码调控RNA有关[3]。miRNA是小的非编码RNA，可以作为致癌因子或抑癌因子，在癌症的发生发展过程中起重要作用，靶向miRNA可能作为诊断和治疗恶性肿瘤的新策略。研究表明，miRNA-34a在乳腺癌、肝癌、胰腺癌等多种肿瘤中异常表达，与肿瘤的进展密切相关[4]。而X连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XⅠAP）是凋亡抑制蛋白家族中作用最强的一种，是与肿瘤发生、发展密切相关的凋亡相关基因[5]。但是关于miRNA-34a、XⅠAP在不同基因分型乳腺癌中的表达情况尚不明确，基于此，本研究旨在探讨miRNA-34和XⅠAP在不同基因分型乳腺癌中的表达情况，并初步探究相关分子机制，以期为乳腺癌的靶向治疗提供一定理论依据，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年1月至2016年6月唐山市妇幼保健院普通外科手术切除后经病理证实为乳腺癌患者的石蜡包埋乳腺癌组织及相应癌旁组织。纳入标准：①术后经病理证实为乳腺癌；②患者病历资料完整；③患者术前未经放化疗及靶向治疗；④组织标本保存完好。排除标准：①合并其他系统的肿瘤；②伴结缔组织疾病；③合并糖尿病、血液系统疾病、免疫系统疾病等。共纳入77例患者，年龄25～76岁，平均（48.31±6.93）岁；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期47例，Ⅲ～Ⅳ期30例；组织学分级：Ⅰ级13例，Ⅱ～Ⅲ级64例；无淋巴结转移37例，有淋巴结转移40例；病理类型：浸润性导管癌65例，其他类型12例。根据乳腺癌组织雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）、人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）表达情况，将77例乳腺癌患者进行基因分型：管腔A型（Luminal A）18例，管腔B型（Luminal B）19例，HER2过表达型（HER2+）19例，三阴性21例。

1.2 实时荧光定量PCR检测miRNA-34 a表达水平

使用TRⅠzol试剂（购自美国Ⅰnvitrogen公司）从液氮冻存的组织中提取总RNA，然后用Reverse Transcription Ki（t购自日本Takara公司）将RNA逆转录为cDNA，后用SYBR Green（购自日本Takara公司）进行实时PCR分析。利用ABⅠ7500系统（购自美国应用生物系统公司）进行实时荧光定量（quantitative real-time，qRT）-PCR检测。以U6作为内参。本研究所有引物均由上海生工生物工程有限公司合成，引物设计如下。miRNA-34a：正义，5'-GACTGAGTACAAACTGGTGG-3'；反义，5'-GTGCAGGGTCCGAGGT-3'。U6：正义，5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'；反义，5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。50 μl PCR 反应体系：10×Buffer 5 μl，2.5 mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）4 μl，taq 酶 0.5 μl，Pmix 2.5 μl，上游引物和下游引物各 1 μl，双蒸水（distillation-distillation H2O，ddH2O）36 μl。PCR 反应条件：94℃预变性2 min，94℃变性25 s，60℃退火35 s，72 ℃延伸20 s，31 个循环。应用2-ΔΔCt法计算miRNA-34a相对表达量，ΔCt=CtmiRNA-34a-CtU6，ΔΔCt=ΔCt乳腺癌组织-ΔCt癌旁组织。

1.3 蛋白免疫印迹（WB）法检测XIAP蛋白表达水平

使用补充有苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF）（Riche）的 RⅠPA 蛋白提取试剂（Beyotime）从组织中提取XⅠAP蛋白质。在4℃2500 r/min下离心10 min后，通过10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离上清液，将分离的蛋白质转移到硝酸纤维素膜上。将膜在磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）和5%脱脂乳中封闭1 h，并用兔抗人XⅠAP多克隆抗体（1∶200）和内部对照兔抗大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）多克隆抗体（Cell Signaling Technology，1∶200）4℃孵育过夜。将膜用辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）缀合的二抗在室温下孵育1 h。使用Quantity One软件（Life Technologies）评估XⅠAP蛋白相对表达水平。

1.4 统计学分析

采用SPSS 20.0统计-软件进行数据处理。计量资料以均数±标准差（x±s）表示，采用t检验；计数资料以率（%）表示，采用χ2检验；相关性分析采用Pearson相关分析；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 乳腺癌组织及癌旁组织中miRNA-34 a和XIAP蛋白相对表达水平的比较

乳腺癌组织中miRNA-34a相对表达水平低于癌旁组织，XⅠAP蛋白相对表达水平高于癌旁组织，差异均有统计学意义（P＜0.05）。不同基因分型乳腺癌组织中miRNA-34a、XⅠAP蛋白相对表达水平比较，差异均有统计学意义（F=7.128，P=0.000；F=3.824，P=0.013）；与Luminal A、Luminal B和三阴性乳腺癌组织相比，HER2+乳腺癌组织中miRNA-34a相对表达水平降低，而XⅠAP相对表达水平升高（P＜0.05）。（表1）

表1 miRNA-34 a及XⅠAP在不同基因分型-乳腺癌组织及癌旁组织中的相对表达水平比较（± s）

表1 miRNA-34 a及XⅠAP在不同基因分型-乳腺癌组织及癌旁组织中的相对表达水平比较（± s）

注：a与癌旁组织比较，P＜0.05；b与Luminal A比较，P＜0.05；c与Luminal B比较，P＜0.05

组织癌旁组织（n=77）乳腺癌组织（n=77）Luminal A（n=18）Luminal B（n=19）HER2+（n=19）三阴性（n=21）miRNA-34a XⅠAP 1.01±0.03 0.53±0.13a 0.61±0.15a 0.55±0.11a 0.41±0.13a b c 0.56±0.16a 0.89±0.16 1.09±0.20a 1.03±0.21a 1.06±0.19a 1.23±0.25a b c 1.05±0.17a

2.2 乳腺癌组织中miRNA-34 a及XIAP蛋白相对表达水平与临床特征的关系

乳腺癌组织中miRNA-34a相对表达可能与年龄、肿瘤直径、组织学分级、ER状态、PR状态无关（P＞0.05）；有淋巴结转移、TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、HER2阳性表达的乳腺癌组织中miRNA-34a相对表达水平均低于无淋巴结转移、TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、HER2阴性表达的乳腺癌组织（P＜0.05）。乳腺癌组织中XⅠAP相对表达可能与年龄、肿瘤直径、组织学分级、淋巴结转移、ER状态、PR状态无关（P＞0.05）；TNM分期为Ⅲ～Ⅳ期、HER2阳性表达的乳腺癌组织中XⅠAP蛋白相对表达水平均高于TNM分期为Ⅰ～Ⅱ期、HER2阴性表达的乳腺癌组织（P＜0.05）。（表2）

表2 不同临床特征乳腺癌组织中miRNA-34 a和ⅠXAP蛋白的表达水平（ n=77）

2.3 乳腺癌基因分型分布与临床特征的关系

不同年龄、TNM分期患者的乳腺癌的基因分型分布比较，差异均有统计学意义（P＜0.01），而不同肿瘤直径、组织学分级、淋巴结转移及病理类型患者的乳腺癌的基因分型分布比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。（表3）

表3 乳腺癌基因分型分布与临床特征的关系（ n=77）

2.4 乳腺癌组织中miRNA-34 a与XIAP相对表达的相关性分析

Pearson相关性分析显示，乳腺癌组织中，随着miRNA-34a相对表达水平的降低，XⅠAP蛋白相对表达水平逐渐提高，二者呈负相关（r=-0.404，P＜0.05）。

3 讨论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，其发病率占全身各种恶性肿瘤的7%～10%[6]。乳腺癌的早期发现、合理治疗能够有效延长患者的生存期，Ⅰ期患者5年生存率达93%，Ⅱ期患者5年生存率达81%[7]。然而，乳腺癌的治疗及预后在同样病理类型、同一临床分期、同种治疗方式的患者中仍存在差异，这些提示乳腺癌存在基因分型。随着分子生物学的发展，乳腺癌基因分型成为其病理学分型的发展和补充[8]。研究表明，由于其异质性，不同基因分型乳腺癌的流行病学危险因素、疾病自然进程、治疗反应存在差异[9]。根据乳腺癌的基因分型指导患者治疗，以提高疾病的诊疗效果仍然是目前的研究热点和难点。

乳腺癌的发生、发展过程与多种致癌基因及抑癌基因的表达相关。致癌基因或抑癌基因表达异常通过调控细胞增殖、迁移参与肿瘤发生、发展过程。miRNA靶向结合mRNA的3’非翻译区（3’UTR）来抑制转录和转录后水平的基因表达[10]，通过调节其他肿瘤抑制因子或致癌基因表达而起到致癌基因或抑癌基因的作用。多种miRNA表达的上调或下调在乳腺癌的发生、发展中起重要作用[11-12]。miRNA-34a作为潜在的抑癌基因，通过下调多种靶标起到抑制肿瘤的作用。过往研究已证实，miRNA-34a在乳腺癌组织中的相对表达水平显著下调，且其表达水平与患者年龄、肿瘤分化程度、肿瘤大小等无明显相关性，而与TNM分期和淋巴结转移有关[13]。与此一致，本研究发现，与癌旁组织相比，乳腺癌组织中miRNA-34a相对表达水平降低，提示miRNA-34a在乳腺癌中起抑癌基因的作用。进一步探讨miRNA-34a与临床特征的关系发现，miRNA-34a相对表达水平与TNM分期和淋巴结转移有关。随着TNM分期的升高，miRNA-34a相对表达水平降低，且有淋巴结转移患者miRNA-34a相对表达水平低于无淋巴结转移患者。研究结果提示，miRNA-34a参与乳腺癌的发生、发展和转移等过程。研究发现，在乳腺癌中，与ER状态有关的miRNA有miRNA-342、miRNA-217、miRNA-206等，与PR状态有关的 miRNA 有 miRNA-377、miRNA-520g、miRNA-93等，而miRNA-520d、miRNA-302c、miRNA-30e等与HER2状态有关[14]。本研究发现，在HER2+乳腺癌中miRNA-34a相对表达水平最低，且在Luminal A、Luminal B、HER2+和三阴性乳腺癌组织中miRNA-34a的相对表达水平比较，差异有统计学意义。另外，miRNA-34a相对表达水平与HER2状态有关，而与ER和PR状态无关。此结果提示，miRNA-34a相对表达水平与乳腺癌基因分型有关。HER2+乳腺癌的生物学行为更为恶性，预后较差，且HER2过表达与乳腺癌的复发及转移有关[15]。由此推测，miRNA-34a表达水平的降低与乳腺癌的恶性进展有关，其在乳腺癌不同基因分型中的差异性表达可能为深入探究不同基因亚型乳腺癌提供理论基础。

XIAP基因作为miRNA-34a的靶基因，在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌等多种肿瘤组织中表达上调，能直接抑制caspase3、caspase7、caspase9蛋白的活性，从而阻止细胞凋亡，参与多种肿瘤的发生发展过程[16]。闫红等[17]发现，XⅠAP在乳腺癌中高表达，且与HER2状态有关，在HER2阳性肿瘤组织中的阳性表达率显著高于HER2阴性肿瘤组织。与此一致，本研究发现，XⅠAP在乳腺癌组织中的表达水平高于癌旁组织，且随着TNM分期的升高，XⅠAP相对表达水平逐渐增加，提示XⅠAP可能参与乳腺癌组织的恶性转化过程。另外，在Luminal A、Luminal B、HER2+和三阴性乳腺癌组织中，XⅠAP蛋白相对表达水平存在差异，XⅠAP蛋白在HER2+型中的相对表达水平高于Luminal A和Luminal B，提示XⅠAP表达与HER2阳性密切相关，与闫红等[17]的研究结果一致。由此推测，XⅠAP可能对乳腺癌发生发展过程中的凋亡起重要调控作用，且与乳腺癌的基因分型有关。

综上所述，本研究发现miRNA-34a在乳腺癌中的相对表达水平下调，与XⅠAP表达呈负相关，且与HER2阳性表达有关。这一结果对于丰富乳腺癌的基因分型和指导治疗具有重要作用。miRNA-34a与XⅠAP的表达与乳腺癌的恶性进展密切相关，二者可能共同参与一种或多种途径调控乳腺癌进程。然而，由于本研究样本量较少，且可能受到病例筛选的随机性和研究误差的影响，在后续研究中需扩大样本量，并更精确地去验证miRNA-34a在不同基因型乳腺癌中的表达情况，以期为疾病的诊疗提供一定理论依据。