3种小檗科植物类黄酮、生物碱含量与抑菌活性的季节变化规律

薛梦莹，李 璐，张华峰，刘紫祺

(1.陕西师范大学西北濒危药材资源开发国家工程实验室 中俄食品与健康科学国际联合研究中心 食品工程与营养科学学院，陕西 西安 710119； 2.西北农林科技大学生命科学学院，陕西 杨凌 712100)

小檗科(Berberidaceae)南天竹(Nandinadomestica)、绿叶小檗(Berberisthunbergii)和红叶小檗(B.thunbergiivar.atropurpurea)是重要的园林绿化植物，具有优良的生态性和独特的观赏性[1-6]。近年来的研究表明，这3种小檗科植物的化学成分具有一定的药用开发价值[3-5]。体外自由基清除试验发现，南天竹、绿叶小檗和红叶小檗的多糖具有一定的抗氧化活性[1]；绿叶小檗甘油提取物和乙醇提取物能够抑制化脓性链球菌(Streptococcuspyogenes)等的生长[7]；红叶小檗的红色素能够抑制枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、大肠杆菌(Escherichiacoli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的生长[8]；南天竹精油能够抑制铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和金黄色葡萄球菌的生长[9]。研究南天竹、绿叶小檗和红叶小檗的化学成分与功能，对于小檗科植物资源的科学开发和综合利用具有一定的参考作用。

小檗科植物共有17个属[1]。大量研究表明，小檗科植物类黄酮和生物碱往往具有较强的抑菌活性[10-11]。小檗科小檗属具芒小檗(B.aristata)的芦丁(rutin)、槲皮素(quercetin)等类黄酮能够抑制多种病原微生物的生长[10,12]；小檗属异果小檗(B.heteropoda)、伊犁小檗(B.iliensis)、针刺小檗(B.iberica)、喀什小檗(B.kaschgarica)和黄芦木(Berberisamurensis)的小檗碱(berberine)对食源性致病菌具有显著的抑制作用[13-14]；淫羊藿属(Epimedium)朝鲜淫羊藿(E.koreanum)的生物碱能够抑制大肠杆菌对数期的繁殖生长，严重破坏菌体表面，使菌体之间相互聚团、粘连[2]；十大功劳属(Mahonia)冬青叶十大功劳(M.aquifolium)的药根碱(jatrorrhizine)能够抑制絮状表皮癣菌(Epidermophytonfloccosum)和痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)的生长[15]。但是，迄今鲜见有关南天竹、绿叶小檗、红叶小檗生物碱和类黄酮抑菌作用的研究报道。

研究南天竹、绿叶小檗、红叶小檗生物碱和类黄酮的抑菌作用，分析季节对类黄酮、生物碱含量与抑菌活性的效应，可能具有以下应用前景：1)有助于开发类黄酮、生物碱抑菌剂或防腐剂，服务医药、食品或饲料工业；2)有助于充分利用疏苗、修剪得到的废弃叶片资源，增加科技附加值；3)有助于拓展3种小檗科植物的应用范围，延长产业链。同传统中草药相比，3种小檗科植物是常见的园林绿化植物，易于规模化种植，资源丰富，成本较低。鉴于此，本研究分析了不同季节南天竹、绿叶小檗、红叶小檗生物碱和类黄酮的含量，探讨了生物碱、类黄酮含量季节变化的可能原因，研究了3种小檗科植物生物碱和类黄酮的抑菌活性及其季节变化规律，以期促进小檗科植物生物碱、类黄酮成分的开发利用。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

不同季节的南天竹、绿叶小檗、红叶小檗叶片2015年采自陕西省西安市。季节划分参考缪启龙和王勇[16]的方法。叶片采摘后用蒸馏水漂洗，而后置通风处阴干，粉碎，过筛(180±7.6)μm，在4 ℃冰箱中密封冷藏，备用。大肠杆菌(菌种代号：ATCC25922)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)(纯度≥99%)、氨苄青霉素钠(ampicillin sodium salt)(USP级)、槲皮素(纯度≥95%)、小檗碱(纯度≥95%)购自上海源叶公司；牛肉膏蛋白胨培养基(pH为7.2～7.4)、琼脂购自北京奥博星公司；三氯化铝、碱式硝酸铋、乙醇等均为国产试剂(分析纯)。

1.2 类黄酮的制备、鉴定与定量分析

称取1.0 g叶片粉末，加入40 mL 60%(V∶V)乙醇，浸泡30 min后，85 ℃加热回流3 h。过滤去除残渣，将滤液浓缩至稠膏状，冻干后得到类黄酮提取物[17]。参照文献[18]方法进行纯化和定性、定量分析。每个试验重复3次。

1.3 生物碱的制备、鉴定与定量分析

参照郝淼等[19]的方法分离、纯化生物碱。采用碘化铋钾显色法鉴定生物碱[20]。采用紫外分光光度法定量分析生物碱[19]。每个试验重复3次。

1.4 抑菌活性分析

1.4.1菌株活化与菌悬液制备 将供试菌接种在斜面培养基上，在37 ℃活化24 h。然后接种于100 mL液体培养基中，在37 ℃振荡培养18 h(振荡速度110 r·min-1)，制得活化菌悬液，用液体培养基稀释到106～107 cfu·mL-1备用。

1.4.2最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)测定 采用经典的二倍稀释法考察不同样品对大肠杆菌的最小抑菌浓度[21]。取9支事先灭菌的试管，依次编号为A、B、C、D、E、F、G、H、I。在A试管中先加入2 mL的液体培养基，再加入2 mL的样品溶液(100 mg·mL-1)，混匀后吸取2 mL混合溶液，加入B试管，再向B试管中加入等体积的液体培养基后混匀，以此类推使样品溶液不断稀释，直至G试管。在H试管中仅加入液体培养基(不加入样品溶液)，作为阴性对照。在I试管中加入液体培养基和氨苄青霉素钠，作为阳性对照。分别向A～I试管中加入400 μL菌悬液，在37 ℃振荡培养18 h(振荡速度110 r·min-1)。用TTC染色法评判大肠杆菌的生长情况[22]。每个试验重复3次。

1.5 数据处理

使用Microsoft Excel软件录入试验数据，使用Microsoft Word软件制作表格，使用SPSS 12.0软件进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，P<0.05、P≥0.05分别表示差异显著、不显著。

2 结果与分析

2.1 类黄酮、生物碱的制备

制得了绿叶小檗、红叶小檗和南天竹的类黄酮与生物碱。3种小檗科植物类黄酮的三氯化铝反应和盐酸-镁粉反应等呈现阳性，生物碱的碘化铋钾显色反应等也呈现阳性，符合标准[18-19]。

2.2 不同季节类黄酮、生物碱含量的变化动态

2.2.1类黄酮含量的变化 绿叶小檗4个季节类黄酮含量的平均值显著高于红叶小檗(P<0.05)，而与南天竹没有显著差异(P≥0.05)。绿叶小檗与红叶小檗亲缘关系较近，但是两者类黄酮含量的差异较大。红叶小檗和南天竹类黄酮的含量随着季节由春季向冬季的递进而逐渐升高，绿叶小檗中类黄酮的水平则表现出先升高后降低的趋势(表1)。红叶小檗的类黄酮水平在冬季最高(3.908%)，显著高于其他季节(P<0.05)。南天竹的类黄酮含量也在冬季最高(6.138%)，显著高于春季和夏季(P<0.05)，但与秋季没有显著差异(P≥0.05)。绿叶小檗的类黄酮水平在夏季最高(6.277%)，显著高于其他季节(P<0.05)。

表1 3种小檗科植物中类黄酮的含量Table 1 Contents of flavonoids in three Berberidaceae species %

同行不同大写字母表示同种植物不同季节之间差异显著(P<0.05)，同列不同小写字母表示同一季节不同物种之间差异显著(P<0.05)。表2同。

Different capital letters within the same row indicate significant difference for the same species in different seasons at the 0.05 level, and different lowercase letters within the same column indicate significant difference between different species in the same season at the 0.05 level; similarly for Table 2.

2.2.2生物碱含量的变化 绿叶小檗四季生物碱含量的平均值显著高于红叶小檗(P<0.05)，而与南天竹没有显著差异(P≥0.05)。红叶小檗的生物碱含量在秋季最高(5.517%)，冬季、夏季次之，春季最低。绿叶小檗的生物碱含量表现为夏季>秋季>春季>冬季。南天竹的生物碱含量表现为夏季>冬季>秋季>春季。总体上看，3种小檗科植物的生物碱水平在夏季普遍较高(表2)。

2.3 类黄酮、生物碱抑菌活性的季节变化

2.3.1类黄酮抑菌活性的变化动态 在一定浓度时，绿叶小檗、红叶小檗和南天竹类黄酮对大肠杆菌均表现出抑制作用(表3)，但均弱于氨苄青霉素钠(10 μg)。同种植物不同季节类黄酮的MIC值不尽相同。红叶小檗类黄酮的MIC值在春季和冬季较小，秋季次之，夏季较大。绿叶小檗类黄酮的MIC值次序为春季<冬季<秋季<夏季。南天竹类黄酮的MIC值在春季、冬季和秋季较小，在夏季较大。总体上看，3种小檗科植物在春季、冬季时类黄酮的抑菌作用相对较强，而在夏季、秋季时相对较弱。冬季时，红叶小檗中类黄酮含量较高(表1)，抑菌活性较强(表5)，值得进一步研究开发。

2.3.2生物碱抑菌活性的变化动态 绿叶小檗、红叶小檗和南天竹生物碱对大肠杆菌均具有抑制作用(表4)。红叶小檗生物碱的MIC值在春季最小，秋季、冬季次之，夏季最大(表5)。绿叶小檗生物碱的MIC值表现为冬季<春季<夏季<秋季。南天竹生物碱的MIC值表现为冬季<春季<秋季<夏季。总体上看，3种小檗科植物在冬季、春季时生物碱的抑菌作用相对较强，而在夏季、秋季时相对较弱。春季时，红叶小檗生物碱的MIC值最低(5 mg·mL-1)。综上可见，红叶小檗的生物碱和类黄酮对大肠杆菌均有较好的抑制效应。

3 讨论

3.1 类黄酮、生物碱含量变异的原因

红叶小檗4个季节的类黄酮含量与绿叶小檗差异较大(表1)。红叶小檗为绿叶小檗的变种，其叶片颜色(砖红色)可能与甲基花青素-3,5-双葡萄糖苷(anthocyanidin-3,5-diglucoside)含量较高有关[8]。植物花青素通常是以黄烷-3,4-二醇(flavan-3,4-diol)为底物，在花青素合成酶(anthocyanidin synthase)催化下合成而得[23]。红叶小檗中甲基花青素-3,5-双葡萄糖苷等花青素的水平与绿叶小檗区别很大[8]，暗示两者的类黄酮代谢途径可能存在较大差异。不同的类黄酮代谢途径可能是引起两者类黄酮含量显著差异的主要原因。

Carmona等[24]研究发现，低温有助于甜橙(Citrussinensis)中花青素的合成与积累。冬季气温较低，有助于花青素的生物合成，这可能是红叶小檗和南天竹类黄酮含量在冬季最高的原因。植物类黄酮的生物合成过程常常受到紫外线等环境因子的影响[25-26]。Guidi等[26]研究认为，植物叶肉类黄酮可以保护叶绿体免受紫外线引起的光氧化损伤，因此紫外线可以促进类黄酮的生物合成。陕西省夏季平均光照时间较长，紫外线照射强度可能较高[27-28]。植物为了应对紫外线胁迫往往合成出更多的类黄酮，这可能是绿叶小檗类黄酮含量在夏季较高的原因。

生物碱对植物本身具有重要的生理生态意义，对植食动物、昆虫具有拒食或毒害作用，还可防御微生物病原的侵害[29-30]。此外，温度、光等环境因子对生物碱的生物合成往往也有较大影响[31-33]。通常，高温有利于生物碱等含氮物质的合成[29]。陕西省夏季平均气温较高，昆虫、微生物病原等对植物的威胁相对严重，因此植物可能会合成出更多的生物碱，这可能是绿叶小檗和南天竹生物碱含量在夏季较高的原因。

表2 3种小檗科植物中生物碱的含量Table 2 Contents of alkaloids in three Berberidaceae species %

表5 3种小檗科植物类黄酮及生物碱的最小抑菌浓度(n=3)Table 5 Minimum inhibitory concentration of flavonoids and alkaloids in three Berberidaceae species (n=3)

季节Season红叶小檗Berberis thunbergii var. atropurpurea类黄酮Flavonoids/(mg·mL-1)生物碱Alkaloids/(mg·mL-1)绿叶小檗Berberis thunbergii类黄酮Flavonoids/(mg·mL-1)生物碱Alkaloids/(mg·mL-1)南天竹Nandina domestica类黄酮Flavonoids/(mg·mL-1)生物碱Alkaloids/(mg·mL-1)春季 Spring7520151512夏季 Summer10875201814秋季 Autumn8740381513冬季 Winter7725131510平均值 Average value8.006.7540.0021.5015.7512.25

3.2 类黄酮、生物碱抑菌活性的机理分析

本研究中，抑菌试验表明，绿叶小檗、红叶小檗和南天竹类黄酮和生物碱对大肠杆菌均具有一定的抑制作用。研究发现，植物类黄酮能够抑制细菌群体感应信号受体、毒素和酶等毒力因子，影响细菌生物膜的形成，破坏细菌对宿主配体的粘附作用[34]。生物碱能够扰乱细菌分裂Z环的形成，抑制核酸合成，影响质膜功能，抑制二氢叶酸还原酶(topoisomerase)和DNA拓扑异构酶(dihydrofolate reductase)活性，从而显示出特定的抑菌效果[2,35]。3种小檗科植物类黄酮、生物碱的抑菌机制尚待进一步探究。

4 结语

本研究分析了不同季节南天竹、绿叶小檗、红叶小檗生物碱和类黄酮的含量，探讨了生物碱、类黄酮含量季节变化的可能原因，研究了3种小檗科植物生物碱和类黄酮的抑菌活性及其季节变化规律，为小檗科植物类黄酮、生物碱活性物质的开发利用提供了思路。本研究发现，绿叶小檗、红叶小檗、南天竹的类黄酮和生物碱含量、抑菌活性都随着季节的变化而存在差异。3种小檗科植物类黄酮、生物碱含量的季节变化可能与光、温度等环境因子密切相关。3种小檗科植物类黄酮、生物碱对模式菌大肠杆菌均具表现出一定的抑制作用。同种植物不同季节类黄酮、生物碱对大肠杆菌的抑制活性不尽相同。在3种小檗科植物中，红叶小檗对大肠杆菌的抑制作用相对较强，春季时红叶小檗生物碱的抑菌活性最强。今后可进一步探究红叶小檗抑菌活性的物质基础和作用机制。