BT抗虫蛋白研究概述

范艳艳 黄义德 周谷成 肖义军

(福建师范大学生命科学学院 福州 350108)

虫害是影响农作物生产的重要因素，转基因作物研究的一个重要目的是抗虫。目前全世界种植面积最广的转基因作物，是抗虫的转Bt基因玉米和棉花以及抗除草剂的转基因玉米和大豆。截至2014年，全球转基因作物种植面积高达1.815亿公顷，中国的种植面积在全球排名第六，其中种植面积最广的是转苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis， Bt)的抗虫蛋白基因(简称Bt基因)的抗虫作物。我国1991年开始研究Bt，成功合成的第一个Bt基因是晶体蛋白基因家族(cry)的cry1A，1997年首次克隆出Bt杀虫晶体蛋白基因。自1997年批准转基因抗虫棉的商业化生产以来，抗虫棉的种植面积与应用率逐年上升。数据显示1997—2014年间，转Bt基因棉花带来的经济效益约为1200亿元。目前，我国已成功克隆285个杀虫晶体蛋白基因，超越美国位居世界第一。且2010年以来，我国发现的新型Bt基因总数占全球的50%以上，多种有明确杀虫功能的基因已获得专利保护。

值得关注的是，转Bt基因玉米中表达的Bt抗虫蛋白在使作物免受虫害的同时，也产生了食用玉米中Bt蛋白的安全性问题，即对昆虫有毒害作用的Bt抗虫蛋白一旦进入人体会否引起中毒成了关注的焦点。本文概述Bt蛋白及其抗虫机制，以及转Bt基因作物的安全性问题。

1 Bt蛋白概况

Bt是一种革兰氏阳性细菌，主要生活在土壤中，也可从昆虫、植物以及水环境中分离获得，它与其他芽胞杆菌的区别是在芽胞形成过程中伴随有杀虫晶体蛋白的产生。转基因研究中所说的Bt蛋白通常是指Bt在芽孢形成过程中母细胞产生的杀虫晶体蛋白，以及在营养生长期产生的营养期杀虫蛋白。Bt蛋白具有良好的抗虫性能，其优越的抗虫性能一直被作为农药用于农业生产中，是世界上使用最广泛的微生物杀虫剂。随着生物科技的发展，将Bt基因转入植物基因组中，制备具有抗虫性能的转基因作物是多年来转基因作物研究的重要内容。

Bt母细胞形成芽胞时产生的杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins, ICPs)主要由细胞外溶解性晶体蛋白基因家族(cyt)和晶体蛋白基因家族(cry)编码，cyt和cry类基因产物对鳞翅目、鞘翅目、膜翅目、双翅目等多种昆虫以及线虫和螨类节肢动物具有特异性杀灭作用[1]，因此广泛用于构建转Bt基因作物。Cry蛋白并不由Bt本身的基因组基因编码，而是由Bt内的质粒基因编码，不同的Bt内含有不同的cry基因，目前克隆得到并命名的杀虫晶体蛋白基因已超过800个。不同的转Bt基因玉米品种产生的Bt蛋白互不相同，其所对抗的虫害也就不同。例如，目前常用的转基因Cry1Ab蛋白主要针对欧洲玉米三化螟、西南玉米三化螟和玉米穗虫等，对玉米根虫就无毒性；而转基因Cry34Ab1蛋白毒杀的是玉米根虫，对欧洲玉米三化螟等就无毒性。因此，可通过构建含有多种Bt蛋白的转Bt基因作物扩展抗虫谱，提高抗虫性能。

2 Bt蛋白的抗虫机制

Bt抗虫蛋白中研究较多的是Cry蛋白，其抗虫的主要机制可由“孔洞形成”模型说明： 昆虫摄取Cry蛋白后，在昆虫体内强碱性的中肠段经碱性蛋白酶消化，形成小分子的活化片段即核心毒素，核心毒素与昆虫中肠部位上皮细胞膜中高丰度的氨肽酶N受体和碱性磷酸酶受体等结合并被富集，然后与中肠上皮细胞刷状缘膜囊泡上的受体结合并被剪切部分片段后发生构象改变，形成寡聚体并插入中肠细胞膜，继而在肠细胞膜上形成允许离子和水分子自由出入的孔洞，导致水分大量流入细胞，引起中肠细胞膨胀裂解，最终导致昆虫死亡[2]。也有人认为Cry蛋白还存在另一种杀虫途径： 即核心毒素通过与昆虫中肠上皮细胞膜上的特殊受体结合，激活调控细胞凋亡相关基因的表达，导致中肠上皮细胞凋亡，从而引起昆虫死亡。

Bt蛋白对昆虫的毒力主要取决于昆虫中肠上皮细胞刷状缘膜囊上的受体，不同昆虫中肠上皮细胞膜上的受体不同决定了Bt蛋白对不同昆虫的选择性毒性，受体与Bt蛋白核心毒素的高亲和力决定了Bt蛋白作用的专一性。目前发现核心毒素的受体主要有类钙粘蛋白、氨肽酶N、碱性磷酸酶以及糖脂等，均与核心毒素高度亲和，其中类钙粘蛋白的亲和力最高，也是最重要的蛋白受体。

类钙粘蛋白均为依赖钙离子的跨膜糖蛋白家族，在机体中主要与细胞连接蛋白相互作用，并通过自身结构域调节细胞的信号转导。类钙粘蛋白与核心毒素特异性结合导致中肠细胞膜孔洞的形成，是引起昆虫死亡的关键因素。不同昆虫的类钙粘蛋白与核心毒素的结合位点不完全一致，无法结合到类钙粘蛋白受体关键区域的Bt蛋白将不能发挥作用[3]。因此，不同的Bt蛋白对不同昆虫具有选择性毒性，它是由昆虫中肠上皮细胞受体与核心毒素之间的特异性识别并结合决定的。氨肽酶N、碱性磷酸酶及糖脂与类钙粘蛋白作用机制相似，均是中肠上皮细胞膜上的重要受体。

长期种植转Bt基因作物的地区，由于转Bt基因抗虫作物中持续高剂量的表达Bt蛋白，使得靶标昆虫长期面临来自Bt蛋白的生存压力，会促使其产生对Bt蛋白的抗性。昆虫中肠上皮细胞膜中特异性受体发生突变是抗性产生的主要原因，也是昆虫抗性防治研究的重要方向。

3 Bt蛋白的安全性

Bt蛋白对人体是否安全是民众关注的焦点。靶标昆虫食用Bt蛋白导致死亡，那么人类食用Bt蛋白是否安全呢?检验Bt蛋白对人体是否具有潜在的威胁，主要看在食品加工过程或食用过程中Bt蛋白的结构与功能是否被破坏，以及人体消化道上皮细胞膜上是否存在与Bt蛋白或其在肠道内的降解产物特异性结合的受体。研究指出： 人体内胃液pH为0.9～1.8，在这种强酸环境下，Bt蛋白可被完全降解；Bt蛋白只有在强碱性条件下才会被部分降解成核心毒素片段，多数昆虫中肠pH为9～10，而人小肠pH约为6.8，可见Bt蛋白会对多数昆虫有毒性作用，但在人体内不会产生毒素；人类基因组与昆虫基因组相差甚远，昆虫体内将Bt蛋白消化成核心毒素的酶以及昆虫中肠上皮细胞膜上的特异性受体，在人体内均不存在；在60℃下加热1min可以使Bt蛋白变性失活，因此Bt蛋白的正常摄入对人体没有威胁。

转基因蛋白的安全性不仅要考虑其毒性，还要考虑其致敏性，确定蛋白质是否具有致敏性的方法包括： 与已知过敏原比对氨基酸序列的同源性、进行模拟胃液消化实验、与细胞表面抗原进行免疫实验等。转基因作物在推广与应用之前，经过了严格的营养学、毒理学、致敏性以及非期望效应等安全评价程序，而且多年的应用并未发现明显的不良后果，因此，批准上市的转Bt基因作物及其种子被认为是安全的，可以正常食用。

转Bt基因作物的安全性问题可能主要在于其对环境和生物多样性方面的影响。利用Bt蛋白对抗昆虫虽然是农业生产的巨大进步，但其对生物多样性与环境是否安全目前尚未有定论，主要有三个方面的问题： 第一，虽然Bt蛋白抗虫谱窄，只对靶标昆虫有较大影响，但杀害靶标昆虫，可通过食物链影响这些昆虫的捕食者及其他生物，使其数量增加或减少，影响生态平衡与生物多样性；第二，Bt蛋白通过植物的花粉、根系或残渣进入土壤，可与土壤黏粒和腐殖酸结合，形成不易被微生物降解且具有杀虫活性的结合态Bt蛋白，使土壤生物多样性等受到不同程度的影响[4]；第三，Bt蛋白对昆虫长期的生存压力易使其产生抗性，一旦大部分昆虫产生抗性，转Bt基因作物将失去其意义，再次大量使用杀虫剂将造成环境污染。目前，转基因作物的种植年限尚短，缺乏其对环境影响的长期研究，尚不能做出Bt蛋白对生物多样性与环境安全性的精准评价。

[基金项目： 教育部人文社会科学研究项目规划基金“核心素养导向的科学课程高中学业水平考试实施策略与命题研究(2017—2020年)”；*通信作者]