三种农药对中华大蟾蜍蝌蚪的急性毒性效应

周志豪，陈星星，陆荣茂，许凯伦，李 敏

(浙江省海洋水产养殖研究所 浙江省近岸水域生物资源开发与保护重点实验室，浙江 温州 325005)

在农业生产中，为了增加土地的产量，引用了大量的农药和化肥。随着农药工业的迅速发展，使用范围不断扩大，大量有毒物质进入土壤、水体、大气及生物体内，通过生物富集和食物链造成了生物体内的残留的显著影响[1]。

两栖动物具有水陆两栖独特的生活周期，由于其特殊的生理学特性如皮肤呼吸，故皮肤的渗透性很强，对污染物的累积作用很明显，因此对水质的反应极为敏感，是监测环境因子变化的极好的指示物种，国外越来越多的学者使用其作为指示生物进行水质的监测，并取得了较好的效果[2-3]。

近年来对全球范围内两栖类动物数量的一项调查发现世界各地的青蛙、蟾蜍和其它两栖类动物的数量日渐减少[4]。农药的大量使用对两栖类的减少起了很大的作用。中华大蟾蜍(Bufo gargarizans)隶属于两栖纲无尾目蟾蜍科，中华大蟾蜍在我国分布较为广泛，见于东北、华东、华北、华中、西北、西南各省区。它不仅是医学实验中常用的实验材料，而且是一种药用价值很高的经济动物[5]。近年来，生态环境不断恶化，中华大蟾蜍的栖息地遭到破坏，适宜其生长的环境越来越少，因而更应引起我们的关注。此次试验便是采用中华大蟾蜍作为试验动物，以观察国内普遍使用的吡虫啉、高效氯氟氰菊酯、甲基硫菌灵这三种农药，通过急性毒性实验，初步评价这三种农药对中华大蟾蜍的影响。

1 材料与方法

1.1 供试动物

试验所用中华大蟾蜍(Bufo gargarizans)蝌蚪捕捞于西安政法大学长安校区一池塘，试验前将捕捞的蝌蚪放在室内常温下盛有清洁自来水的玻璃缸(60cm×25cm×35cm)中驯养7天，曝露在空气中，水体pH值6.5～7.0，期间每隔3天换一次水，每天定时投喂饲料1次，试验前停止一天喂食。

1.2 所用试剂及仪器

1.2.1 主要试剂

甲基硫菌灵(70%)、高效氯氟氰菊酯(10%)、吡虫啉(70%)均来自陕西上格之路生物科技有限公司。

1.2.2 仪器

两栖动物蝌蚪培养玻璃缸；培养皿；200 mL量筒；1000 mL容量瓶；尼龙纱网，移液器，移液管。

1.3 母液的配置

(1)甲基硫菌灵母液的配置：试验所用甲基硫菌灵农药的有效浓度为70%的，购自陕西上格之路生物科技有限公司。试验前准确称量10g原药，用自来水定容至1L，配置成7g/L 甲基硫菌灵的1L母液。保存备用，试验开始时稀释成试验所需浓度的暴露溶液。

(2)高效氯氟氰菊酯母液的配置：试验所用高效氯氟氰菊酯的有效浓度为20%，购自陕西上格之路生物科技有限公司。试验前准确称量0.1mL原药，用自来水配定容至1L，制成 100μg/L的高效氯氟氰菊酯的母液保存备用，试验开始时稀释成试验所需浓度的暴露溶液。

(3)吡虫啉母液的配置：试验所用吡虫啉的有效浓度为70%，购自陕西上格之路生物科技有限公司。试验前准确称量1.43g原药，用自来水定容至1L，配制成2g/L吡虫啉的母液保存备用，试验开始时稀释成试验所需浓度的暴露溶液。

1.4 试验条件

以自来水作为试验用水。试验所用容器为培养皿，每容器盛试验液200 mL，随机放入发育期相同(26期左右)，个体相近、体重相近的健康蝌蚪(全长：(3.0±0.1) cm；体重(0.5±0.1)g )的中华大蟾蜍蝌蚪10例。试验用水pH值7.0 左右，硬度(90±5) mg/L (CaCO3)，水温(18±2)℃，自然光照周期条件下培养，试验期间不投食。为保证试验浓度的准确性，每24h 更换全部试验液。

1.5 试验方法

表1 急性毒性试验所用三种农药的浓度梯度设置

各农药均根据预试验结果设置 8个浓度组，见表1，另均设自来水对照组。为避免蝌蚪发生同类相食现象及死亡蝌蚪毒性分泌物对正常蝌蚪产生影响，暴露后前12 h连续观察，之后每间隔4h进行一次观察。当蝌蚪沉于水底，用玻璃棒多次刺激其尾部无反应时则判断为死亡，及时将死亡蝌蚪捞出，记录24、48、72、96 h 死亡蝌蚪的数目。

1.6 数据处理与分析

所有试验数据均采用SPSS 16.0软件进行统计分析。采用概率单位法[ 6-7]。中华大蟾蜍蝌蚪的半数致死质量浓度(LC50)及95%置信区间。安全浓度参照下式计算[8]：安全浓度(SC)=0.01× 96 h LC50。

2 结果与分析

2.1 甲基硫菌灵对中华大蟾蜍蝌蚪的急性毒性

在整个急性毒性试验过程中，对照组蝌蚪游动正常，无死亡现象。不同浓度组的死亡个数和死亡率见表2，结果显示试验组中各期蝌蚪的死亡个数均随着暴露时间的延长和药物浓度的增加而逐渐增加。

通过回归分析，在相同时间内蝌蚪死亡率与溶液浓度存在线性正相关。得出24,48,72,96h的死亡几率对(y)与浓度(x)的回归方程(表3)，溴氰菊酯对中华大蟾蜍蝌蚪的24h-，48h-，72h-，96 h-LC50分别5.736 mg/L，4.727 mg/L,4.407 mg/L，4.065 mg/L。依据安全浓度计算公式(0.01×96 h-LC50)，得出溴氰菊酯对中华大蟾蜍蝌蚪的安全浓度为0.040 mg/L。

表2 不同浓度甲基硫菌灵处理中华大蟾蜍蝌蚪的累计死亡数和死亡率

表3 蟾蜍死亡率与甲基硫菌灵浓度的线性回归方程

注： y为死亡几率；x为甲基硫菌灵浓度；a 为斜率；b 为方程截距。

2.2 高效氯氟氰菊酯对中华大蟾蜍蝌蚪的急性毒性

在整个急性毒性试验过程中，对照组蝌蚪游动正常，无死亡现象。不同浓度组的死亡个数和死亡率见表4，结果显示试验组中各期蝌蚪的死亡个数均随着暴露时间的延长和药物浓度的增加而逐渐增加。

通过回归分析，在相同时间内蝌蚪死亡率与溶液浓度存在线性正相关。得出24,48,72,96 h的死亡几率对(y)与浓度(x)的回归方程(表5)，溴氰菊酯对中华大蟾蜍蝌蚪的24h-，48h-，72h-，96h-LC50分别18.66μg/L，16.35μg/L,12.80μg/L，12.17μg/L。依据安全浓度计算公式(0.01×96 h-LC50)，得出溴氰菊酯对中华大蟾蜍蝌蚪的安全浓度为0.122 μg/L。

表4 不同浓度高效氯氟氰菊酯处理中华大蟾蜍蝌蚪的累计死亡数和死亡率

表5 蟾蜍死亡率与高效氯氟氰菊酯浓度的线性回归方程

注：y为死亡几率；x为高效氯氟氰菊酯浓度；a 为斜率；b 为方程截距。

2.3 吡虫啉浓度对中华大蟾蜍蝌蚪的急性毒性

在整个急性毒性试验过程中，对照组蝌蚪游动正常，无死亡现象。不同浓度组的死亡个数和死亡率见表6，结果显示试验组中各期蝌蚪的死亡个数均随着暴露时间的延长和药物浓度的增加而逐渐增加。

通过回归分析，在相同时间内蝌蚪死亡率与溶液浓度存在线性正相关。得出24,48,72,96 h的死亡几率对(y)与浓度(x)的回归方程(表7)，吡虫啉对中华大蟾蜍蝌蚪的24h-，48h-，72h-，96h-LC50分别13.95mg/L，391.92mg/L,367.50 mg/L,358.71 mg/L。依据安全浓度计算公式(0.01×96h-LC50)，得出溴氰菊酯对中华大蟾蜍蝌蚪的安全浓度为3.58m g/L。

表 6 不同浓度吡虫啉处理中华大蟾蜍蝌蚪的累计死亡数和死亡率

表7 蟾蜍死亡率与吡虫啉浓度的线性回归方程

注：y为死亡几率；x为吡虫啉浓度；a 为斜率；b 为方程截距。

2.4 3种农药对中华大蟾蜍蝌蚪LC50的比较

通过急性毒性试验得出三种农药对中华大蟾蜍蝌蚪的96h-LC50分别为：甲基硫菌灵4.06 mg/L，高效氯氟氰菊酯12.17μg/L，吡虫啉358.71 mg/L。96 h-LC50浓度越大，说明该农药的毒性越小，反之则越大，因此，本试验所选以三种农药对中华大蟾蜍蝌蚪的毒性大小依次为：高效氯氟氰菊酯>甲基硫菌灵>吡虫啉。

3 讨论

3.1 三种农药处理浓度、暴露时间与死亡率之间的关系

甲基硫菌灵，高效氯氟氰菊酯，吡虫啉三种农药对中华大蟾蜍蝌蚪的急性毒性实验结果分别如表2、表4、表6所示。从中可以得出，在同一时间内随着处理浓度的升高，中华大蟾蜍蝌蚪的死亡率也逐渐升高，而在同一处理浓度下随着时间的延长中华大蟾蜍蝌蚪的死亡率也逐渐升高。

3.2 三种农药对中华大蟾蜍蝌蚪的半致死浓度比较

实验结果显示，所选三种农药对中华大蟾蜍蝌蚪均有一定的急性毒性效应，但中华大蟾蜍蝌蚪对不同农药的敏感性存在一定的差异。相同试验条件下，甲基硫菌灵、高效氯氟氰菊酯、吡虫啉对中华大蟾蜍蝌蚪的半致死浓度不同(表3、 表5、表7)较96 h半致死浓度可知，高效氯氟氰菊酯的96 h-LC50最小，甲基硫菌灵96 h-LC50次之，而吡虫啉96h-LC50最大，毒性最弱。因此试验所选三种农药对中华大蟾蜍蝌蚪的急性毒性大小依次为：高效氯氟氰菊酯 >甲基硫菌灵>吡虫啉。

4 结论

本研究以中华大蟾蜍(Bufo gargarizans)蝌蚪为试验对象，选取农业中广泛使用的三种农药对其进行了急性毒性试验，得到下列结论：相同试验条件下，甲基硫菌灵、高效氯氟氰菊酯、吡虫啉对中华大蟾蜍(Bufo gargarizans)蝌蚪的96 h半致死浓度(96 h-LC50)分别为4.06 mg/L、9.84 mg/L、358.71 mg/L，安全浓度分别为0.041 mg/L、0.121μg/L、3.58 mg/L。三种农药中，高效氯氟氰菊酯对中华大蟾蜍的毒性最强，甲基硫菌灵的毒性居中，吡虫啉的毒性最弱。中华大蟾蜍蝌蚪具有分布区域广、易取材、易培养等特点。本实验结果表明，中华大蟾蜍蝌蚪对农药的毒性效应反应比较敏感，可以考虑用作水体农药污染监测的指示生物。