外源植物激素、冷湿层积和变温处理对悬钩子属光滑高粱泡种子休眠与萌发的影响

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(1.湖北民族学院，林学园艺学院，种子生物学实验室， 湖北 恩施 445000；2.湖北省恩施土家族苗族自治州气象局， 湖北 恩施 445000)

种子休眠是指在特定时期内，不管各种有利于种子萌发的环境因子(如温度和光照/黑暗等)以何种组合形式都不能使其萌发的现象[1]。它是植物在长期的自然进化过程中形成的应对自然环境和保存种族的一种适应特性[2]，对于新物种的产生和现有物种的扩散具有重要意义[3]。而在生产实践中，种子休眠对于人类来说有利有弊，利在于休眠能使种子成功度过不适宜其萌发生长的特殊时期；弊在于播种时休眠会降低种子活力、影响出苗整齐度，并严重制约大规模常规育种和种苗生产[2]。

根据休眠原因，种子休眠可以分为生理休眠、形态休眠、形态生理休眠、物理休眠和复合休眠等五大类型，每一休眠类型又可进一步分为若干休眠水平，且有些休眠水平还可进一步分为若干休眠型[1-4]。其中，生理休眠是进化上最高、系统发生树上分布最广的休眠类型[1-5]。通常，可通过温度处理、机械处理、层积处理、光照处理、激素处理、化学药剂处理及综合处理等方法来解除种子休眠，使其萌发[6-8]，并可由此分析其休眠原因及确定其休眠的类型、水平和休眠型[1]。

蔷薇科(Rosaceae)悬钩子属(Rubus)植物全世界约有750个种，分布遍及五大洲。中国约有194个种88个变种，分布遍及全国各地[9-10]。该属很多植物均具有开发利用价值，有些种类的果实柔嫩多汁，营养丰富，可食用；有些种类的果实、种子、根及叶可入药，具有活血化瘀、清热解毒、止血止痛等功效[10]。光滑高粱泡(RubuslambertianusSer.var.glaberHemsl.)是悬钩子属高粱泡(R.lambertianusSer.)的一个变种，其果实可食，可加工成果汁、果酒或提取色素用作饮料添加剂[11]；其根和叶可入药，有活血调经、消肿解毒的作用[12]。高粱泡的生态适应性强，是23种优良悬钩子种质资源之一[11-13]，极具开发潜力。

悬钩子属植物种子具有深度休眠特性，给选育种及物种保护等工作造成一定困难[14]，明确其休眠原因并找到高效的休眠解除方法具有重要意义。已有研究表明，悬钩子属植物种子休眠原因复杂多样，包括硬质种皮(实为内果皮)妨碍透水透气和胚生长[15-16]，种皮或胚乳内含萌发抑制物质[16-17]，胚发育不充分[14]等。用于解除悬钩子属植物种子休眠的方法主要有机械破皮处理、化学试剂处理、植物激素处理、低温层积处理和变温处理等[14]。目前有关高粱泡(R.lambertianus)种子休眠的研究鲜见报道，仅见张春红等对高粱泡种子利用98% H2SO4和NaClO浸种后室温沙藏(90 d)处理，但均未能有效解除休眠[18]，而对于变种光滑高粱泡种子休眠的研究尚未见报道。鉴于高粱泡的潜在利用价值，很有必要探明其种子休眠原因，并找到解除其休眠的最佳方法，为其规模繁殖和育种等工作的开展奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试光滑高粱泡种子于2017年10月采自湖北省恩施鹤峰县木林子国家级自然保护区。去除果皮和杂质后于室温条件下阴干备用。

1.2 方 法

1.2.1 外源植物激素处理

选择具有促进种子休眠解除和萌发的外源植物激素GA3和6-BA对光滑高粱泡种子进行处理。2种外源植物激素溶液均配制成0.000 1，0.001，0.01，0.1 mmol/L和1 mmol/L等5种浓度，以蒸馏水处理作为对照(ck)。

1.2.2 冷湿层积处理

将新鲜成熟种子与湿润的珍珠岩(含水量60%，握之成团，松手即散)按体积比1∶3充分混匀后装于黑色聚乙烯袋中，随后将其置于4 ℃黑暗条件下进行冷湿层积处理。层积2，4，6，8周后取样，并在指定温度和光照条件下进行萌发测试，以未经层积处理的新鲜成熟种子为对照(ck)。

1.2.3 变温处理

设置2种变温：15 ℃/25 ℃和20 ℃/30 ℃，均为12 h光照/12 h黑暗交替光照条件(PPFD=121μmol/(mDK·s)，每天的光照时间与变温的高温阶段相对应。

1.2.4 萌发测试

所有萌发测试试验均设置4次重复，每重复50粒种子，将种子均匀播于垫有2层滤纸的培养皿中，每皿添加6 mL蒸馏水或不同浓度的外源植物激素溶液，为防止培养期间水分蒸发，每个培养皿在添加完蒸馏水或不同浓度的外源植物激素溶液后用封口膜进行密封处理。然后置于指定温度(恒温或变温)和光照[每天12 h光照/12 h黑暗交替光照，PPFD=121μmol/(m·s)]条件下进行培养，定期记录萌发数，萌发测试结束后统计并计算最终平均萌发率。以胚根突破内果皮作为萌发标准。

表1 冷湿层积对光滑高粱泡种子在各恒温条件下休眠解除和萌发的影响

层积时间(周)萌发率10℃15℃20℃25℃30℃35℃01.5±0.5cB20.0±5.0aB27.0±4.6aA23.0±5.9aA10.0±1.6bA1.0±0.6cA20bB9.5±1.3aB16.5±3.4aA14.0±5.0aA6.0±2.2aA0bA41.5±1.5bB18.5±4.4aB15.5±6.0aA27.0±6.5aA4.0±0.8bA0bA635.5±13.0bA55.5±5.9aA11.0±2.4bA12.0±3.8bA8.0±2.2bA0cA842.5±9.2aA50.5±10.6aA27.0±2.5abA18.0±4.1bA6.0±1.2cA0dA

注：同列标有相同大写字母或同行标有相同小写字母的数据间无显著性差异(p=0.05)。

初始萌发测试：培养温度分别为5，10，15，20，25，30，35 ℃和40 ℃恒温，培养期为30 d。

外源植物激素处理萌发测试：培养温度为20 ℃，培养期为60 d。

冷湿层积处理后萌发测试：冷湿层积处理不同时间的种子分别被置于10，15，20，25，30 ℃和35 ℃恒温条件下培养，培养期为30 d。

变温处理萌发测试：培养期为30 d。

1.2.5 数据分析

利用SPSS 22.0软件对所有的萌发数据进行统计分析。所有萌发数据均进行单因素方差分析(one-way ANOVA，p=0.05)，其中初始萌发测试、外源植物激素处理和冷湿层积处理的萌发数据随后还要进行Student-Newman-Keuls验后多重比较(p=0.05)。为了保证方差齐性，所有萌发数据在进行方差分析前都要先进行反正弦转换。所有统计图均通过GraphPad Prism 5.0软件完成。

2 结果与分析

2.1 新鲜光滑高粱泡种子在恒温条件下的初始萌发

恒温对新鲜光滑高粱泡种子休眠解除和萌发具有显著性影响(p<0.05,图1)。15，20，25 ℃条件下的最终平均萌发率间无显著性差异(p>0.05)，并显著高于其他恒温条件下的最终平均萌发率(p<0.05)，其中以20 ℃恒温条件下的最终平均萌发率最高，为(27.0±4.6)%。30 ℃条件下的最终平均萌发率次之，为(10.0±1.6)%；10 ℃和35 ℃条件下的最终平均萌发率最低，不到5%，且两者无显著性差异(p>0.05)；5 ℃和40 ℃条件下则不萌发(图1)。

2.2 变温处理对新鲜光滑高粱泡种子休眠解除和萌发的影响

与20 ℃恒温条件下的萌发进程相比，2种变温处理均能够有效解除光滑高粱泡种子的休眠并促进其萌发(图2)。2种变温处理的最终平均萌发率显著高于20 ℃恒温(最适恒温，见图1)条件下的最终平均萌发率(p<0.05)，且2种变温处理的最终平均萌发率间无显著性差异(p>0.05)，均达95%以上(图2)。

注：每天12 h光照/12 h黑暗，PPFD=121 μmol/(m·s)。标有相同小写字母的数据间无显著性差异(p=0.05)。下同。图1 新鲜光滑高粱泡种子在各恒温条件下的萌发

图2 新鲜光滑高粱泡种子在2种变温和1种最适恒温条件下的萌发进程

2.3 GA3和6-BA对新鲜光滑高粱泡种子休眠解除和萌发的影响

不同浓度的GA3和6-BA溶液处理的最终平均萌发率与对照相比，均没有显著性差异(p>0.05,图3)。

2.4 冷湿层积处理对光滑高粱泡种子休眠解除和萌发的影响

冷湿层积处理能够在一定程度上促进光滑高粱泡种子休眠的解除及其萌发(表1)。随着冷湿层积处理时间的延长，光滑高粱泡种子在10 ℃和15 ℃条件下的最终平均萌发率有增加趋势(p<0.05)，而对其他恒温条件下的最终平均萌发率则没有显著性影响(p>0.05,表1)。冷湿层积6周的光滑高粱泡种子在15 ℃条件下达到最高平均萌发率，为(55.5±5.9)%(表1)。

注：萌发温度为20 ℃，每天12 h光照/12 h黑暗交替光照，PPFD=121 μmol/(m·s)。标有相同小写字母的数据间无显著性差异(p=0.05)。图3 GA3(A)和6-BA(B)溶液处理对新鲜光滑高粱泡种子休眠解除和萌发的影响

3 结论与讨论

目前，关于悬钩子属植物种子休眠与萌发的研究结果存在很大差异。张春红等[19]用GA3溶液处理黑莓Kiowa种子效果不明显，而低温层积处理则能够有效地促进其休眠解除和萌发。这与我们在光滑高粱泡种子休眠解除和萌发实验中所得的结果相类似。然而，龚娜等[20]却发现冷湿层积处理对黑莓和树莓早红种子休眠解除和萌发没有促进作用。这或许是因为种或品种不同所致，黑莓和树莓是悬钩子属多种植物的统称，并且已人工培育出多个品种[21]，而两篇文献中均未标明相应的拉丁学名；另外，即使同种植物种子，其休眠的有无及休眠原因或休眠类型也可能存在差异。同种植物种子中可能有些种子有休眠，有些种子无休眠[1]；并且，同种植物种子中也可能存在多种休眠类型[22-23]，如心叶椴(TiliacordataMill.)种子中有些是复合休眠，有些是生理休眠[23]。

根据恒温条件下的初始萌发和冷湿层积处理试验结果，以及Baskin等[1]的种子休眠分类系统，新鲜光滑高粱泡种子应该无物理休眠，即种皮(实为内果皮)不限制透水透气，并很可能具有浅生理休眠。冷湿层积处理能够有效促进其种子休眠的解除和萌发(表1)，然而2种外源植物激素(GA3和6-BA)处理却无显著效果(图3)。浅生理休眠种子的休眠解除和萌发是能够被GA促进的[4]，但不同种子需要不同的处理浓度，本研究可能未能找到合适的处理浓度，6-BA对种子休眠解除和萌发的促进同样也依赖于浓度。

层积处理能够促进很多植物种子的休眠解除[24]，如黄栌(Cotinuscoggygria)种子的复合休眠(物理休眠+生理休眠)[25]。在本研究中，冷湿层积处理也显著促进了光滑高粱泡种子的萌发，然而与Deng等[25]实验中冷湿层积显著促进了黄栌种子在从低到高各温度下的萌发有所不同，冷湿层积处理仅显著提高了光滑高粱泡种子在10 ℃和15 ℃低温下的萌发率，最终平均萌发率最高分别达到(42.5±9.2)%[未经层积处理的对照组的平均萌发率为(1.5±0.5)%]和(55.5±5.9)%[未经层积处理的对照组的平均萌发率为(20.0±5.0)%]，而对其在20 ℃及其以上较高温度条件下的萌发未显示出促进作用(表1)。这或许是因为本实验中冷湿层积处理时间还不够长，也或者是2种植物种子的休眠机制有所不同。

变温处理可有效解除少数悬钩子属植物种子的休眠[17]。新鲜光滑高粱泡种子在15 ℃/25 ℃和20 ℃/30 ℃变温条件下培养时未显示出休眠特性，或者说2种变温条件有效促进了休眠的解除，最终平均萌发率均达95%以上(图2)。

综上所述，光滑高粱泡种子应该属于浅生理休眠类型，最佳休眠解除方法为在15 ℃/25 ℃变温条件下处理20 d以上，其次为在4 ℃左右冷湿层积6周以上。