4种边坡常见蕨类孢子人工种子萌发技术研究

， ， ， ， ， (深圳市铁汉生态环境股份有限公司， 广东 深圳 518040)

蕨类植物也称羊齿植物，是介于苔藓植物和种子植物之间的一个独具特色的高等植物类群，在西方素有“无花之美”之称[1-2]。蕨类植物是观赏植物的重要组成部分，不仅可用于园林造景、室内盆栽、立体绿化等方面，也可用于水体净化、重金属修复和边坡绿化等[3-5]。随着路桥和隧道等工程大量建设产生的裸露坡面日益增多，边坡修复工程已成为目前生态环境建设的一项重要内容[6]。目前边坡绿化防护工程常用的技术有客土喷播、湿法喷播、植生袋和混播植草等，而湿法喷播因具有均匀、省时和省种等特点，应用比较广泛[7-8]。我国大部分工程在喷播中主要选用乔灌草的模式，但随着灌木的生长，草本植物会逐渐退化，一定程度上影响了边坡稳定性[9]。而蕨类植物一般都具有较强的耐荫性，大部分也可以产生大量孢子，若能适当的把蕨类孢子结合乔灌草利用湿法喷播运用到边坡修复中，不仅可以解决后期草本植物退化后林下空脚的问题，也可丰富边坡植物种类和增强边坡生态群落稳定性。但蕨类植物孢子一般比较小，萌发受到光照、温度和水分等多种条件的影响[10]，这在一定程度限制了蕨类孢子能以草本植物种子一样的方式进行喷播。而人工种子技术是植物繁殖的一个途径，也可以一定程度上控制作物生长发育和抗性[11-12]。通过在人工胚乳中添加一些营养液、植物激素、碳源或抗菌剂等，可以显著提高种子萌发率，增加植物的繁殖速度，有的甚至可以促进植物生长[13-15]。但是目前关于华南地区自然分布的蕨类孢子萌发研究还不够完善，特别是孢子人工种子技术方面的研究数据几乎没有，为促进蕨类孢子未来在边坡绿化中应用，本试验以华南毛蕨、蜈蚣蕨、线羽凤尾蕨和乌毛蕨4种蕨类孢子为研究对象，通过正交试验研究了在人工胚乳中添加MS、激素和多菌灵对孢子萌发的影响，并进一步研究了不同光照和储存时间对孢子人工种子萌发的影响。

1 材料和方法

1.1 材 料

参试材料为线羽凤尾蕨、华南毛蕨、蜈蚣蕨和乌毛蕨的成熟孢子，其孢子叶采集后于室内荫晾 2～3 d 并收集，储存于 4 ℃冰箱。

1.2 方 法

将各处理放置在人工气候箱内培养，培养温度为 25～30 ℃，光照强度 2 000～2 500 lx，相对湿度 75%～85%，光照时间 12 h/d。

1.2.1 筛选孢子人工种子促萌最佳组合

称取 0.002 g 孢子倒入10 mL 含 1.5%海藻酸钠的包埋剂中，制成孢子悬浮液，然后将孢子悬浮液倒入直径 9 cm 的玻璃培养皿中，使孢子液均匀分布于培养皿中，最后将盛有孢子液的培养皿浸泡在 2%的氯化钙溶液中，15 min 后取出培养皿，用蒸馏水漂洗 2～3 次，即得蕨类孢子海藻酸钙平板。

采用 L9(34)正交试验法研究人工种子包埋剂中添加不同浓度的 MS 大量元素、KT、赤霉素及多菌灵对蕨类孢子萌发的影响。正交试验中因素和水平如表 1 所示，各处理编号见表 2。

表1 L9(34)正交试验的因子和水平设计

水平因子大量元素KT浓度(mg/L)GA3浓度(mg/L)多菌灵浓度(%)10000.0521/2MS0.2250.103MS0.5500.20

表2 包埋剂正交试验处理设计

处理编号 大量元素 KT浓度(mg/L) GA3 浓度(mg/L) 多菌灵浓度(%) 1 MS 0.2 50 0.052 MS 0.5 0 0.103 1/2MS 0 50 0.104 1/2MS 0.5 25 0.055 1/2MS 0.2 0 0.206 0 0.5 50 0.207 0 0 0 0.058 MS 0 25 0.209 0 0.2 25 0.10

1.2.2 不同光质对孢子人工种子萌发的影响

对4种蕨类孢子人工种子平板进行制作，制作方法如1.2介绍，包裹剂设置为 MS+GA350 mg/L+多菌灵 0.05%，然后放置于 4 种光照下进行培养。不同光质的配比及光照度如表 3 所示。

表3 不同光质的配比和光照强度

编号 LED光质 光照强度(lx)G1全光谱 2220～2720 G2红光 510～660 G3红光 830～1260 G4红蓝4∶11040～1200 G5红蓝6∶11060～1210

1.2.3 不同贮藏时间对孢子萌发的影响

通过添加促萌物质(ck,未加 GA3和MS的海藻酸钙平板)和不添加促萌物质(添加GA3和MS的海藻酸钙平板)，定时对储藏孢子的萌发率进行测定。

1.3 数据处理

采用 Excel 2013软件对数据进行计算。运用 SPSS 20.0 软件进行统计分析。利用最小显著差数(LSD)法在α=0.05水平对数据进行多重比较和方差分析。

2 结果与分析

2.1 筛选孢子人工种子促萌最佳组合

正交试验结果如表4所示，培养12 d时4种蕨的孢子萌发率在各处理间差异极显著，其中处理5，6，9中萌发率均为0，华南毛蕨和乌毛蕨在处理2中萌发率也为0。其他处理中，线羽凤尾蕨的萌发率为66.12%～81.65%，华南毛蕨为 32.55%～66.45%，乌毛蕨为 33.7%～76.38%，蜈蚣蕨的萌发率为42.23%～92.31%。

方差分析结果(表5)表明，大量元素浓度，KT 浓度和多菌灵浓度对4 种蕨类孢子萌发率具有极显著的影响，而GA3浓度对华南毛蕨、乌毛蕨和蜈蚣蕨的孢子萌发率具有极显著的影响，但是对线羽凤尾蕨孢子萌发并无明显的促进作用。综合来看，4个因素对不同蕨类孢子萌发的影响主次关系分别为：线羽凤尾蕨 D>A>B>C，华南毛蕨B>D>A>C，乌毛蕨 D>B>A>C，蜈蚣蕨 D>B>A>C，因此 KT 浓度和多菌灵浓度对其影响较大，大量元素和 GA3浓度影响较小。

各因素对蕨类孢子萌发影响结果见表6，从大量元素浓度看，添加大量元素均有利于提高孢子萌发率，除了乌毛蕨孢子在 50%大量元素浓度培养条件下萌发率较高以外，其余 3 种蕨类孢子萌发率随着大量元素浓度增加而增加，因此促萌的最佳大量元素浓度为 100%；KT 浓度的影响则相反，未添加 KT 处理的孢子萌发率均高于添加处理，说明孢子萌发不需要添加KT；GA3作为一种可破眠催芽的生长激素，添加 25～50 mg/L 时可以促进孢子萌发；抑菌剂多菌灵浓度越高，萌发率越低，因此以添加 0.05%的低浓度为宜。综上所述，蕨类孢子萌发的最优组合为 A3B1C3D1,即在人工种子中添加 MS 大量元素，赤霉素 50 mg/L，多菌灵0.05%，可有效促进孢子萌发。

表4 不同包裹剂对4种蕨类孢子人工种子萌发的影响(12 d)

物种 处理编号萌发率(%)线羽凤尾蕨180.13±4.25a线羽凤尾蕨266.12±5.43b线羽凤尾蕨367.19±4.01b线羽凤尾蕨481.65±3.31a线羽凤尾蕨50.00±0.00c线羽凤尾蕨60.00±0.00c线羽凤尾蕨767.68±9.13b线羽凤尾蕨871.34±6.48b线羽凤尾蕨90.00±0.00c华南毛蕨162.36±4.08a华南毛蕨20.00±0.00d华南毛蕨353.13±2.76b华南毛蕨432.55±1.20c华南毛蕨50.00±0.00d华南毛蕨60.00±0.00d华南毛蕨763.25±4.44a华南毛蕨866.45±1.36a华南毛蕨90.00±0.00d乌毛蕨162.46±5.53b乌毛蕨20.00±0.00d乌毛蕨362.17±2.55b乌毛蕨475.41±1.80a乌毛蕨50.00±0.00d乌毛蕨60.00±0.00d乌毛蕨776.38±7.03a乌毛蕨833.7±6.12c乌毛蕨90.00±0.00d蜈蚣蕨192.31±6.85a蜈蚣蕨242.23±3.41b蜈蚣蕨387.53±4.78a蜈蚣蕨491.00±1.77a蜈蚣蕨50.00±0.00c蜈蚣蕨60.00±0.00c蜈蚣蕨788.05±1.40a蜈蚣蕨887.04±3.63a蜈蚣蕨90.00±0.00c

注：不同字母表示在 0.05 水平上差异显著。

表5 不同包裹剂对 4 种蕨类孢子人工种子萌发率影响的方差分析

变异来源 Ⅲ型平方和 自由度 均方 FSig. 线羽凤尾蕨大量元素(A) 11271.407 2 5635.704 127.015 0.000 KT 浓度(B) 7907.630 2 3953.815 89.109 0.000 GA3浓度(C) 192.074 2 96.037 2.164 0.144 多菌灵浓度(D) 12682.296 2 6341.148 142.914 0.000 华南毛蕨大量元素(A) 2229.556 2 1114.778 231.531 0.000 KT 浓度(B) 12680.222 2 6340.111 1316.792 0.000 GA3浓度(C) 1418.667 2 709.333 147.323 0.000 多菌灵浓度(D) 6561.556 2 3280.778 681.392 0.000 乌毛蕨大量元素(A) 1961.556 2 980.778 72.551 0.000 KT 浓度(B)7226.000 2 3613.000 267.263 0.000 GA3浓度(C) 1216.222 2 608.111 44.984 0.000 多菌灵浓度(D) 18781.556 2 9390.778 694.660 0.000 蜈蚣蕨大量元素(A) 9272.889 2 4636.444 410.439 0.000 KT 浓度(B) 15854.222 2 7927.111 701.744 0.000 GA3浓度(C) 1569.556 2 784.778 69.472 0.000 多菌灵浓度(D) 18528.667 2 9264.333 820.121 0.000

注：R方=0.976(调整R方=0.965)。

表6 各因素对 4种蕨类孢子人工种子萌发率的影响

因素水平 萌发率均值(%)线羽凤尾蕨华南毛蕨乌毛蕨蜈蚣蕨大量元素A022.56 21.1125.4429.3350%49.4428.5645.8959.56100%72.56 43.0032.0073.78KT 浓度 B0 68.6761.0057.4487.560.2mg/L 26.7820.7820.7830.670.5mg/L 49.1110.8925.1144.44GA3浓度 C0 44.5621.1125.4443.4425mg/L50.8933.1136.3359.3350mg/L49.1138.4441.5659.89多菌灵浓度 D0.05% 76.4452.7871.3390.330.1% 44.3317.6720.7843.330.2% 23.7822.2211.2229.00

2.2 不同光质对孢子人工种子萌发的影响

表7表明，在5种不同光照下，线羽凤尾蕨萌发率在 58.71%～71.28%之间，其中全光照(G 1)下萌发率最高，显著高于G 2、G 4和G 5，但与G 3相差不明显，说明G 1和G 3在一定程度上可以促进线羽凤尾蕨孢子萌发；华南毛蕨的萌发率为 39.33%～53.19%，其中红光(G 2)下萌发率最高，显著高于G 1、G 3和G 5，但与G 4相差不明显，说明G 2和G 4在一定程度上可以促进华南毛蕨孢子萌发；乌毛蕨萌发率为31.79%～55.08%，红光(G 3)下萌发率最高，显著高于其它4种光，说明G 3可以促进乌毛蕨孢子萌发；而蜈蚣蕨的萌发率均高于80%，且各处理间基本上无明显差异，说明这几种光对蜈蚣蕨孢子萌发没有影响。

表7 不同光质对 4 种蕨类孢子人工种子萌发的影响(12 d)

物种光萌发率(%)发育阶段线羽凤尾蕨G171.28±7.42a丝状体G264.32±2.79c丝状体G370.55±4.95ab丝状体G458.71±0.72c丝状体G564.75±5.58bc丝状体华南毛蕨G139.33±3.98c片状体G253.19±3.23a丝状体G342.65±2.73bc片状体G448.76±5.77ab片状体G540.48±2.07bc片状体乌毛蕨G131.79±5.94de片状体G246.16±7.51bc片状体G355.08±6.55a片状体G40.00±0.00g-G50.00±0.00g-蜈蚣蕨G185.04±3.50ab片状体G286.31±1.31ab幼配子体G383.33±5.67bc片状体G488.77±4.34a幼配子体G587.07±3.99ab幼配子体

注：不同字母表示在0.05水平上差异显著。

2.3 不同贮藏时间对孢子萌发的影响

储藏时间对蕨类孢子萌发的影响如表 8所示，储藏 30 d 时除了线羽凤尾蕨的对照处理萌发率仅为26.55%以外，其余3种蕨的萌发率均在 90%以上；储藏超过 6 个月时蜈蚣蕨和乌毛蕨的萌发率为0，华南毛蕨的萌发率从 93%下降至67%，在储藏时间为 9 个月时华南毛蕨萌发率仅为28.30%，而线羽凤尾蕨的萌发率也降低至39%。可见这4种蕨类孢子储藏时间不宜超过半年。

表8 不同储藏时间对孢子人工种子萌发的影响

物种处理萌发率(%)30d60d150d180d270d线羽凤尾蕨ck26.55±8.8767.68±9.1371.7±5.5256.76±8.3716.56±1.96促萌86.15±2.3581.65±3.3166.7±5.9671.09±7.9739.71±1.36华南毛蕨ck92.39±1.9163.25±4.4456.51±4.3267.09±6.650.00±0.00促萌93.65±1.7766.45±1.3664.6±4.5342.96±4.2928.30±6.51蜈蚣蕨ck90.61±2.8288.05±1.4089.53±3.180.00±0.000.00±0.00促萌95.88±2.2192.31±6.8585.17±6.110.00±0.000.00±0.00乌毛蕨ck93.25±2.7876.38±7.0373.67±2.650.00±0.000.00±0.00促萌93.87±0.9475.41±1.834.66±3.090.00±0.000.00±0.00

采用孢子作为蕨类植物繁殖材料宜随采随播，若需储藏，储藏时间不宜超过 6 个月；通过海藻酸钙法对蕨类植物孢子进行包埋可在一定程度上促进孢子的萌发，适宜的包埋剂为海藻酸钠 1.5%+MS+GA350 mg/L+多菌灵 0.05%+2%氯化钙。

3 结论与讨论

3.1 筛选孢子人工种子促萌最佳组合

人工种子在自然条件下的萌发率决定着其能否在生产上应用，但关于人工种子有菌萌发的研究并不理想，通常在人工种子制作过程中添加杀菌剂、防腐剂和植物激素等，一定程度上可以促进人工种子的萌发率[16-18]。本研究发现，大量元素浓度，KT 浓度和多菌灵浓度对 4 种蕨类孢子萌发率具有极显著的影响，而 GA3浓度只对华南毛蕨、乌毛蕨和蜈蚣蕨的孢子萌发率具有极显著的影响。KT 浓度和多菌灵浓度对4种蕨类孢子人工种子萌发的影响较大，大量元素和 GA3浓度影响较小。大量元素有利于提高孢子人工种子萌发率，KT不利于萌发，添加 25～50 mg/L GA3可以促进萌发，抑菌剂多菌灵的浓度越高，萌发率越低，以添加 0.05%的低浓度为宜。人工种子中添加 MS 大量元素，赤霉素50 mg/L，多菌灵0.05%，可有效促进孢子萌发。

研究表明，选择胚状体制作人工种子时，在人工胚乳中加入一定量的蔗糖、碳源或其他营养物质有利于促进人工种子的萌发[19-20]。特别是培养基中无机盐浓度对大部分蕨类植物孢子萌发有显著影响，但不同蕨类孢子的最适培养基不同，如薄叶碎米[21]在1/2 MS培养基上萌发率最高，肾蕨[22]孢子的萌发在不同培养基上差异不显著，而银粉背蕨[23]、蕨菜[24],粗梗水蕨[25]在MS培养基上萌发率最高，这与本文的研究结论相同，即在人工种子中添加MS培养基可以有效促进4种蕨类孢子的萌发。一般情况下，赤霉素可以打破孢子休眠进而促进孢子萌发[26]，Antonietta[27]研究发现，在茶枝柑人工种子中附加GA3能够将萌发率由26.7%提高到50%。王晓倩研究发现，用100 mg/L的赤霉素处理阔鳞鳞毛蕨孢子可以有效的促进其萌发[28]，蒋胜军等研究也发现，用5.77 mol/L的赤霉素处理猴腿蹄盖蕨孢子可以促进其萌发[29]。但本研究发现，GA3对华南毛蕨、乌毛蕨和蜈蚣蕨的孢子萌发率具有极显著的影响，而对线羽凤尾蕨影响不显著，可能是因为线羽凤尾蕨孢子不具有休眠特性。

本研究发现，未添加 KT 的处理孢子萌发率均高于添加处理，说明KT不利于这4种孢子萌发。而黄超群研究发现，在培养基中添加KT对红盖鳞毛蕨和井栏边草孢子萌发影响不大[30]，这可能是由于不同孢子休眠特性和自身含有内源激素共同作用进而导致对外界激素生理反应的结果不同。

3.2 不同光质对孢子人工种子萌发的影响

自然状态下，大多数蕨类孢子需要在光照条件下才能萌发[31]，但不同蕨类孢子的萌发对不同光质的反映不同。如王禾等通过研究红光和白光对粗茎鳞毛蕨孢子萌发影响发现，红光能促进孢子提早萌发1 d左右，但对提高萌发率效果不显著[32]，张光飞等研究发现，蜈蚣蕨的孢子需要在光照条件下才能萌发[33]。本研究发现，在实验处理12 d时，G 1(全光照)和G 3(红光长)在一定程度上可以提高线羽凤尾蕨孢子的萌发率；G 2(红光短)和G 4(红蓝光4∶1)可以提高华南毛蕨孢子的萌发率；G 3(红光)可以提供乌毛蕨孢子萌发率；而蜈蚣蕨孢子的萌发率在这4种光下没有显著性差异。导致这些差异的原因可能是孢子的萌发除了与外界环境条件相关外还与自身的遗传特性等相关。

3.3 不同贮藏时间对孢子萌发的影响

研究发现，线羽凤尾蕨在储藏60 d时萌发率最高，随储藏时间延长萌发率降低，可见线羽凤尾蕨适合采收后2个月播种，这和沈晓岚[34]的研究结果相似，即二叉鹿角蕨的孢子经过消毒储藏2～3个月后萌发率最高，随后萌发率随时间延长逐渐降低。而其它3种蕨在储藏30 d时萌发率最高，随后萌发率逐渐降低，可见这3种蕨适合随采随播。可能是因为不同种蕨类植物孢子的活力和寿命有差异，其次蕨类孢子是否含有叶绿体也影响其储藏时间，一般含有叶绿体的孢子，不经过休眠可直接萌发，而不含有叶绿体的孢子要经过一段时间才能萌发，但孢子的活力会保持更久，也可以贮藏较长时间[10]。

综上所述，一定的激素处理和适宜的储存时间及光照可以促进线羽凤尾蕨、华南毛蕨、蜈蚣蕨和乌毛蕨的孢子萌发，这4种蕨又是边坡常见种类，自然传播能力强，可以考虑在边坡植被建植中进行推广。但孢子萌发是一个复杂的基因调控过程，它不仅与自身的遗传特性有关，也与外界环境条件息息相关，特别是原叶体向孢子体转化的过程，这个时期对外界环境极其敏感，在孢子数量一定的情况下，采取一定的技术措施才能保证后期的成苗量，但目前的研究是远远不够的，因此如何根据边坡立地条件、施工工艺、植物配置等不同而有的放矢的采取促萌、保湿及包衣等措施来保证孢子萌发及生长所需的光照、水分和养分等条件，还有待进一步研究。