GST融合蛋白表达系统在实验教学中的应用

张淑芝， 李学红， 刘春香

(潍坊学院 生物与农业工程学院,山东省高校生物化学与分子生物学重点实验室，山东 潍坊 261061)

0 引 言

实验教学是高校课程体系的重要组成部分，对提高学生的动手操作能力和实践创新能力有着不可或缺的作用。在传统的生物学实验教学过程中，验证性实验较多，而综合设计性实验较少；各实验独立单一，联系性不强[1-2]。为了培养学生的创新能力和科研素质，提高实验教学效果，在保留原有的生物学实验课程的基础上，增设了生物学开放性实验[3-5]。

近年来，随着各模式生物基因组测序的相继完成，蛋白质组学发展成为生命科学领域新的研究热点。蛋白质是基因功能的最终执行者，研究蛋白质结构和功能对于探究生命奥秘，指导医药卫生具有重要意义[6]。获得大量高纯度有活性的蛋白质是进行蛋白质研究的基本条件。GST融合蛋白表达系统作为一种常见的原核蛋白表达系统[7]，本身具有细胞增殖速度快、蛋白表达量高、稳定性好、表达产物易于纯化等优点，而被广泛应用于各实验研究[8-11]。

水通道蛋白(Aquaporin，AQP)是一类广泛分布于细胞膜上的高效水分子转运孔道，目前已经发现的水通道蛋白家族成员有13个(AQP0～AQP12)[12-13]。AQP7归属水通道蛋白的第2个亚家族，是一种存在于细胞膜上的水和甘油双转运孔道，因在脂肪代谢、动脉粥样硬化等生理条件下发挥重要作用，而成为近年来的研究热点[14-17]。本文选用与教师科研课题相结合的题目，基于GST融合蛋白表达系统构建原核表达载体pGEX-4T-1∕AQP7，IPTG诱导表达GST-AQP7融合蛋白，并对表达产物进行纯化。

1 材料与方法

1.1 材 料

pGEX-4T-1表达载体、E.coliDH5α菌株、E.coliBL21菌株为本实验室保存。pMD18-T载体、连接酶、限制性内切酶、DNA 相对分子质量标准为TAKARA 公司产品；PCR相关产品、IPTG、蛋白相对分子质量标准为生工生物工程(上海)股份有限公司产品；Glutathione Sepharose 4B为Pharmacia公司产品。

1.2 扩增AQP7-C末端亲水性肽段区基因片段

参照Genebank数据库，借助核苷酸序列分析软件DNA Strider对小鼠AQP7基因全序列进行亲水性分析。引物选取：上游5′-GAATTCCCACAGGATCCTC-AGAG-3′，下游5′-CTCGAGCACAGAGCCACTTATG-3′。以实验室现有质粒pcDNA3.1/AQP7为模板，PCR扩增AQP7-C末端，自796～894位共99bp的亲水性肽段区基因片段。扩增参数：95 ℃ 1 min；94 ℃ 45 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，30个循环；72 ℃延伸10 min。

1.3 构建重组载体pMD18-T/AQP7和pGEX-4T-1/AQP7

pMD18-T和PCR扩增产物混合，室温条件下T4连接酶连接1 h。将连接产物与感受态细胞DH5α按1∶10的体积比进行转化，37 ℃培养过夜，挑取单克隆，继续培养后，进行重组质粒提取。用限制性内切酶EcoRⅠ和XhoⅠ对pMD18-T/AQP7重组质粒酶切鉴定，选取阳性质粒，回收对应的AQP7-C末端亲水性肽段区基因片段。回收片段与双酶切后的pGEX-4T-1表达载体16 ℃过夜连接，转化，质粒提取，并对重组表达载体pGEX-4T-1/AQP7进行PCR鉴定和DNA测序分析。

1.4 表达纯化GST-AQP7融合蛋白

取10 μL pGEX-4T-1/AQP7重组表达载体转化入100 μLE.coliBL21感受态细胞，接种LB/Amp+固体培养基，37 ℃培养过夜。挑取单菌落克隆接种于LB/Amp+液体培养基，先进行2 mL小量培养，当细菌生长达到对数生长期，即菌液OD600值为0.5时，加入不同浓度的IPTG诱导蛋白表达，IPTG浓度依次设置为0、0.1、0.2、0.5 mmol/L。SDS-PAGE电泳检测蛋白表达情况，优化表达条件，确定有效诱导GST-AQP7融合蛋白表达的IPTG浓度。将转化pGEX-4T-1/AQP7质粒的菌液扩大培养，大量诱导表达GST-AQP7融合蛋白，超声裂解细菌，离心，取上清，用Glutathione Sepharose 4B亲和层析法收集上清液中的融合蛋白，经洗脱液洗脱，得高纯度的GST-AQP7融合蛋白。

2 结果与分析

2.1 AQP7-C末端肽段亲水性分析

用DNA Strider序列软件对AQP7基因全序列进行亲水性分析，结果如图1所示，水平线上方为AQP7疏水肽段区;下方为亲水肽段区。为提高融合蛋白的可溶性，以利于后续对表达蛋白的纯化，本研究选取AQP7-C末端，自266～298共33个氨基酸的亲水性肽段区为研究对象。

图1 AQP7蛋白序列亲水性分析

2.2 AQP7-C末端基因片段的PCR扩增

以pcDNA3.1/AQP7质粒为模板，PCR扩增AQP7-C末端亲水区基因序列，琼脂糖凝胶电泳结果显示在约100bp处出现特异性条带(见图2)，与预期设计的99bp DNA片段长度相符合。

2.3 重组质粒pMD18-T/AQP7的酶切鉴定

重组质粒pMD18-T/AQP7经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析，结果呈现一大和一小两条带，大片段为pMD18-T载体(2692bp)，小片段为AQP7-C末端亲水性肽段区基因片段(99bp)，如图3所示。酶切鉴定结果表明重组质粒pMD18-T/AQP7构建成功。

图2 AQP7-C端亲水区基因片段的PCR扩增

M-DL2000 DNA分子量标准,1～2-AQP7-C末端亲水区基因片段的PCR扩增产物

图3 重组质粒pMD18-T/AQP7的酶切鉴定

M-DL2000 DNA分子量标准,1，2-重组质粒pMD18-T/AQP7的EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切鉴定结果

2.4 重组表达载体pGEX-4T-1/AQP7的鉴定

选取鉴定正确的pMD18-T/AQP7重组质粒，酶切回收AQP7-C末端亲水性肽段区基因片段，连接到pGEX-4T-1原核表达载体，构建重组表达载体pGEX-4T-1/AQP7。将构建好的pGEX-4T-1/AQP7进行PCR鉴定，电泳结果呈现约99bp的特异条带(见图4)，证明重组表达载体构建正确。用表达载体pGEX-4T-1特异性的引物进行DNA测序，结果如图5所示，进一步证实了目的基因的正确性。

图5 重组表达载体pGEX-4T-1/AQP7的测序结果

2.5 GST-AQP7融合蛋白的诱导表达及纯化

将转化重组表达载体pGEX-4T-1/AQP7的对数生长期菌液用不同浓度的IPTG诱导，优化表达条件。发现,当IPTG浓度为0.1 mmol/L时，融合蛋白表达效率最高，故选取该浓度大量诱导表达GST-AQP7融合蛋白。收集菌体，超声裂解破碎细胞，离心，取上清液，用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化融合蛋白，SDS-PAGE蛋白电泳，考马斯亮蓝染色，结果如图6(a)所示。表明Glutathione Sepharose 4B亲和层析法可有效纯化GST-AQP7融合蛋白，经纯化后的上清液中几乎没有融合蛋白残留。扩增的AQP7-C末端亲水区基因片段大小为99bp，对应的蛋白相对分子质量约4kD，因为GST标签本身相对分子质量约为26kD，计算GST-AQP7融合蛋白的相对分子质量约为30kD，SDS-PAGE蛋白电泳结果验证了表达的GST-AQP7融合蛋白大小的正确性(见图6(b))。上述实验结果表明，融合蛋白在E.coli BL21原核细胞中高效表达且被有效纯化。

(a) Glutathione Sepharose 4B亲和层析法对GST-AQP7融合蛋白的纯化效率鉴定

M-蛋白分子量标准,1-GST标签蛋白对照,2-纯化的GST-AQP7融合蛋白,3-Glutathione Sepharose 4B结合后的上清液

M-蛋白分子量标准,1，4-BSA蛋白对照(66kD),2，5-纯化的GST-AQP7融合蛋白(30kD),3，6-GST标签蛋白对照(26kD)

3 结 语

GST融合蛋白表达系统作为众多蛋白表达系统中的一种，因表达效率高，纯化条件温和，能很好地保持蛋白固有的结构和功能而被广泛应用于各实验研究[8-11]。本实验涉及目的基因的克隆，表达载体的构建，目的蛋白的诱导表达与纯化，涵盖了现代分子生物学的多项关键实验技术，可以很好地训练学生的实验操作技能。借助实验，学生分析问题和解决问题的能力同样得到了提升，例如在确定IPTG有效诱导浓度的问题上，学生通过尝试设置不同浓度的对比实验，最终确定本实验中诱导GST-AQP7高表达的IPTG浓度为0.1 mmol/L；在菌体的超声裂解问题上，为保证菌体的有效破碎，同时又要兼顾GST-AQP7融合蛋白的完整性，学生经过多次预实验，最终将超声程序设定为：超声5 s，间歇5 s，共重复25次。学生在顺利完成上述实验的基础上，对本实验的后续研究表现出浓厚的兴趣，如：融合蛋白中GST标签的切除，对纯化蛋白的进一步鉴定及有效应用等。因此，本实验还有很大的延伸空间，可以指导学生根据自身的专业基础和学习兴趣，开展后续实验研究，以培养学生的科学探究精神。