基于线粒体基因分析黑颈鹤和灰鹤的遗传差异

王野影， 白志周， 熊 勇， 张明明， 粟海军

(1. 贵州师范大学 生命科学学院 植物生理与发育调控重点实验室, 贵阳 550025; 2. 贵州大学生物多样性与自然保护研究中心, 贵阳 550001)

黑颈鹤(Grusnigricollis)和灰鹤(Grusgrus)隶属于鹤科(Gruidae)，冠鹤亚科(Balearicinae)，鹤属(Grus)。黑颈鹤作为大型飞行涉禽，活动范围极其广泛。在中国，黑颈鹤主要在新疆东昆仑-阿尔金山地区[1]、四川若尔盖湿地国家级自然保护区[2]、贵州草海国家级自然保护区[3]、西藏日喀则地区[4]、云南大山包黑颈鹤自然保护区[5]等地繁殖或越冬。灰鹤是大型涉禽，在我国大部分地区均可看到。黑颈鹤和灰鹤的食性、鸣叫行为、取食范围[6]、生理指标均相近[7]，而且经笔者观察，草海黑颈鹤和灰鹤存在混群生活的现象，然而它们的遗传差异目前不得而知。

线粒体DNA是细胞核外的遗传物质，是可以在基因组水平上研究的分子标记，具有母系遗传的特点，其分子量小、结构简单、无内含子、种内几乎无重排、进化速度快、无组内特异性等特点，是研究动物遗传分化的有力工具[8]。本研究测定了黑颈鹤和灰鹤部分个体的线粒体COI基因，结合GenBank数据库中的黑颈鹤和灰鹤的线粒体COI基因及基因组序列，对黑颈鹤和灰鹤分别从多个体的COI基因及单个体的线粒体基因组进行比较分析，探讨其遗传差异。

1 材料与方法

1.1 材料

于2016年1月从贵州草海国家级自然保护区获得了8份黑颈鹤粪便和4份灰鹤粪便。粪便样品均来自于黑颈鹤和灰鹤的觅食地。利用远距离观察法，待黑颈鹤或灰鹤取食离开后，采用无菌手套进行粪便收集，收集时为避免样品重复，收集的粪便间距均大于2 m，全部实验样品都浸泡在含无水乙醇的EP管中，冰袋冷藏，立即运回实验室，并于-20°C冰箱冷冻保存。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

实验采用粪便基因组DNA 提取试剂盒(Stool Genomic DNA Kit，康为世纪)进行粪便的DNA提取，提取方法参阅试剂盒所带说明书，由于此试剂盒提取的DNA浓度很低，为了提高浓度，在初始时粪便尽量称取0.3 g，结束时，加30 μL水溶解DNA，于4℃冰箱保存待用。

1.2.2 PCR扩增及测序

参考GenBank中鹤属鸟类的COI序列，使用Primer primier 5.0软件设计简并引物，用于从提取的粪便DNA中扩增黑颈鹤和灰鹤的COI基因。引物序列如表1，引物由上海生工生物工程技术有限公司合成。采用普通PCR进行扩增，反应程序：95℃预变性3 min；95℃变性30 s，50℃复性30 s，72℃延伸1 min，重复30个循环；72℃再延伸8 min。反应体系为25 μL，包括：TaqPCR Master Mix (2×，blue dye)12.5 μL，上下游引物各1 μL(10 μmol/L)，模板1 μL (10～100 ng/μL)，加ddH2O补足。PCR扩增产物直接送此公司进行单向测序，测序引物选择5348F或6085R均可。

表1 黑颈鹤和灰鹤COI基因引物设计序列

1.2.3 序列分析

首先使用BioEdit v7.0.5(http://www.mbio.ncsu.edu/bioedit/page2.html)对测序所得峰图文件进行检验，保证使用的序列均为单峰。结合从GenBank数据库中下载的黑颈鹤和灰鹤的COI序列，整理成一个Fasta文件。后使用MEGA7.0[9]软件对此文件进行碱基组成(Base composition)及遗传距离分析：采用p-距离法重复1000次，分析黑颈鹤和灰鹤的种间遗传距离；采用Kimura 2-参数模型重复1000次，分别分析黑颈鹤和灰鹤的种内遗传距离；对黑颈鹤和灰鹤的线粒体基因组进行核苷酸组成，蛋白编码基因核苷酸组成的比较分析。使用DnaSPv6[10]软件进行黑颈鹤和灰鹤的COI的变异位点 (Variable sites)、简约信息位点 (Parsimony informative sites)、单倍型及单倍型多样性的分析，对线粒体基因组各段基因进行变异位点分析及比例计算。

2 结果与分析

2.1 序列组成分析

本实验共获得黑颈鹤COI基因8条，灰鹤COI基因4条，从GenBank数据库下载黑颈鹤COI基因3条、线粒体基因组序列1条(FJ769851.1)，灰鹤COI基因5条、线粒体基因组序列1条(FJ769849.1)，序列详细信息参见表2。从表2中的采集地可以看出，黑颈鹤和灰鹤的COI基因序列可能来自不同种群(迁徙鸟类，无法确定)。手动将参差不齐的序列取齐，共获得COI基因序列片段长度637 bp，其中，黑颈鹤序列中 A+T 含量为 51.20%，G+C 含量为 48.80%；而灰鹤序列中 A+T 含量为 51.80%，G+C 含量为 48.20%；说明二者的COI序列转换与颠换的发生率近似，而这种存在AT偏好性的现象也同样发生在其他脊椎动物中[14]。利用DnaSPv6软件分析发现，黑颈鹤的变异位点和简约信息位点均为0，单倍型为1，单倍型多样性为0，核苷酸多样性为0，说明COI基因并不适用于黑颈鹤种群间的差异分析；灰鹤的变异位点为1，简约信息位点为0，单倍型为2，单倍型多样性为0.032 47，核苷酸多样性为0.000 39，说明灰鹤种群间的COI基因有轻微变异，但此基因仍不适用于灰鹤种群内的遗传差异分析。然而，黑颈鹤和灰鹤COI序列间的变异位点为11个，简约信息位点为10，所以COI适用于作为黑颈鹤和灰鹤种间分析的分子标记。基于11只黑颈鹤和9只灰鹤的COI基因，共计20条序列，计算的种间遗传距离为0.016；黑颈鹤和灰鹤的种内遗传距离均为0，说明黑颈鹤和灰鹤的种内交流频繁且变异小。

表2黑颈鹤和灰鹤的COI基因和线粒体基因组的GenBank检索号及序列来源

2.2 比较线粒体基因组分析

黑颈鹤的线粒体基因组序列长度为16 646 bp，灰鹤的为16 649 bp，包含13个蛋白编码基因，22个tRNA基因，2个rRNA基因和一个控制区。通过对两种鹤的线粒体基因组基因组成和各基因的变异位点及其所占比例(表3)发现：两种鹤的线粒体基因排列顺序均与鸟类典型的线粒体基因排列顺序一致[15]；除16SrRNA基因片段长度有2 bp的差异外，其余基因均等长。各基因中变异位点所占比例高于线粒体基因组变异位点比例(0.020 31)的基因有控制区ND1(0.020 70)、ND2 (0.024 98)、tRNATyr(0.028 17)、ATP8(0.028 74)、ATP6(0.026 32)、ND3(0.025 57)、ND4(0.021 93)、tRNASer(0.030 30)、ND5(0.030 85)、Cytb(0.028 00)、CR(0.046 28)和ND6(0.024 90)。其中，CR、tRNASer、tRNATyr、Cytb的变异位点比例较高，但tRNASer和tRNATyr片段较短，所含信息量较少，不足以提供足够的信息位点，因此，本研究认为CR和Cytb可作为区分黑颈鹤和灰鹤的分子标记。

表3 黑颈鹤和灰鹤线粒体基因组比较

3 讨论

3.1 遗传差异分析

遗传多样性是物种保持进化潜能的基础[16]，研究物种的遗传多样性对濒危物种的保护、保护等级及优先保护单元的确定具有极为重要的意义。其中，遗传变异作为保护遗传学研究的重要内容，从一定程度上可反映遗传多样性。本研究中，黑颈鹤COI基因的核苷酸多样性和单倍型多样性均为0，灰鹤COI基因的核苷酸多样性和单倍型多样性比黑颈鹤偏高，两种鹤的遗传多样性都处于极低水平，各种群均未出现遗传分化，说明需要对这两种鹤加大保护力度，以降低灭绝风险。

3.2 分子标记选择

合适的分子标记在物种鉴定、种群遗传学和系统进化研究中至关重要[17]。在黑颈鹤和灰鹤的线粒体全基因组的37个基因中有12个基因的变异位点所占比例高于全线粒体基因组，说明除线粒体基因组外，还有其他基因可作为黑颈鹤和灰鹤系统发育位置的分子标记。COI作为分子标记常用于昆虫的分子系统学中，鸟类分类学研究中应用较少，被认为适用于分析科内属间的系统发育关系[18]，在本研究中COI基因的变异位点所占比例仅为0.009 66，仅高于12SrRNA(0.008 26)、COII(0.007 31)和几个变异位点所占比例为0的tRNA基因，但仍可以区分黑颈鹤和灰鹤。控制区CR又称D-loop区，由于所受选择压力较小，进化速率相对较快，被认为是线粒体基因组中碱基替换和长度变异最大的区域[19]，黑颈鹤和灰鹤的CR基因均符合这一规律。Cytb基因被广泛应用于鸟类系统学研究中，在黑颈鹤和灰鹤的蛋白编码基因中，Cytb的变异位点所占比例仅次于CR。在今后的研究中可考虑将这两个基因作为潜在的分子标记用于有效区分黑颈鹤和灰鹤，而且研究已证实CR可用于区分灰鹤、丹顶鹤和白头鹤的不同种群[20]，Cytb是否可用于区分其它鹤属鸟类、鹤类种群还需进行深入分析。