明胶海绵微粒-TACE治疗15例大肝癌术后外周血Treg细胞的变化及意义

任志忠， 刘 影， 岳元勋， 杨晓伟， 黄 鑫， 张跃伟

1995 年 Sakaguchi等［1］首次报道在正常人外周血CD4+T细胞中有一群持续高表达CD25分子的细胞——调节性T淋巴细胞（Treg），Treg细胞与肿瘤的免疫逃逸有关。已有研究证实，肝癌患者外周血Treg细胞数量增加［2］。射频消融、TACE是治疗肝细胞肝癌（HCC）有效方法，同时能够有效降低HCC患者外周血 Treg细胞含量［3-5］。 明胶海绵微粒（GSMs）-TACE是目前国内外研究热点，术后肿瘤显著坏死是疗效的病理特征之一。本中心较早应用GSMs治疗BCLC B期和C期患者取得良好安全性和临床疗效［6］，术后3 h即可见肿瘤坏死改变。本研究通过检测GSMs-TACE术后不同时间点外周血Treg含量水平，初步探讨GSMs-TACE对机体免疫功能影响。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选择2016年7月至2018年5月在我院初次行GSMs-TACE的HCC患者15例（见表1）患者平均年龄为（47±12）岁。所有入组肝癌患者按照《原发性肝癌规范化诊治专家共识条例》，均行2种以上影像检查或肝肿瘤活检病理证实为HCC，选择患者均为大肝癌：最大肿瘤病灶直径均＞5 cm。选择7名志愿者作为健康对照组。随访截止时间为GSMs-TACE术后30 d。

表1 肝癌患者一般资料

1.2 方法

1.2.1 GSMs-TACE治疗 入组肝癌患者行GSMs-TACE治疗。应用Seldinger法穿刺右侧股动脉，引入RH肝管，常规行腹腔动脉、肝总动脉造影。根据肿瘤部位、大小及肿瘤染色是否完整等情况，结合影像资料，辅助行膈动脉、肠系膜上动脉、右肾动脉、肋间动脉、胃左动脉、胸廓内动脉等造影，以明确肿瘤所有供血来源动脉。术中依据肿瘤大小、微导管超选情况、有无动静脉瘘及术前的肝功能评分，选择不同直径的GSMs。应用30 mg表柔比星稀释液与GSMs制成微粒悬浮液。DSA透视下经导管缓慢推注化疗药与GSMs悬浮液至肿瘤供血动脉，停止栓塞直至出现血流停滞或对比剂反流，再次造影显示肿瘤染色完全消失。术后常规给予3～5 d保肝（2到3组保肝药：多烯磷脂酰胆碱20 mL、还原性谷胱甘肽1.8 g、复方甘草酸苷15 mL）、补液（总液体量 2 000～2 500 mL）、止吐（昂丹司琼 8 mg，盐酸甲氧氯普胺 10 mg）、止痛（地佐辛/6 h）、抗炎（头孢唑林钠 1 g，2次/d）、退热（体温 38.5℃以下物理降温，超过38.5℃赖氨匹林1 g）、抑酸（奥美拉唑40 mg）治疗。

1.2.2 血液标本采集及标本处理 所有患者均签署知情同意书，在GSMs-TACE术前1 d和术后4、10、20、30 d常规行肝肾功、血常规、异常凝血酶原、甲胎蛋白检查，术后4 d行上腹部CT平扫，术后30 d行上腹部增强CT或MRI检查。所有大肝癌患者于GSMs-TACE 术前 1 d，术后 10、22 d（15～30 d 的均值）用肝素钠抗凝剂采血管采集前臂静脉外周血2 mL，应用流式细胞技术进行外周血Treg细胞含量的测定。健康对照组与肝癌患者GSMs-TACE治疗前1 d同时采集前臂静脉血2 mL进行外周血Treg细胞含量的测定，并保存数据进行统计学分析。

1.2.3 Treg全血处理过程 ①使用抗凝管收集静脉穿刺的血液；②取出1个干粉试剂管（底部已有CD25/CD4/CD127/CD3抗体），加入100 μL的全血于干粉试剂管底部；③旋涡轻振荡0.5～1 s，混匀。孵育 15 min，室温（15～25℃），避光；④将 500 μL红细胞裂解液加入试管中。孵育15 min，室温，避光；⑤每测试管加入PBS溶液2 mL，振荡，在室温下离心5 min，离心力为300 g；⑥除去上清液，重复步骤5一次；⑦除去上清液，每个试管中加入PBS溶液500 μL。1 h内上流式细胞仪进行检测；⑧流式图圈门方案：Treg：CD4+、CD3+；CD25+、CD127+Low的细胞群。

1.3 统计学处理

采用SPSS 19.0软件进行数据统计分析，计量资料用（x±s）表示，两两组间比较采用t检验。检验水准α＝0.05。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝癌患者GSMs-TACE术前与健康人外周血Treg细胞含量

肝癌患者与健康人对照组在年龄、性别等一般资料上比较差异无统计学意义（P＜0.05）。肝癌患者GSMs-TACE术前Treg细胞含量，即Treg细胞（CD25+、CD127+Low）占 Th 细胞百分比（CD3+、CD4+）为（11.52±3.78）%，健康对照组 Treg 细胞含量为（8.64±1.94）%，肝癌患者外周血中Treg细胞含量显著高于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 GSMs-TACE术前与术后 10、22 d外周血中Treg细胞含量变化

Treg细胞含量在TACE术后10 d有所下降（9.07±1.94）%，术后 22 d 升高至（9.96±1.48）%。外周血Treg细胞含量在术后10、22 d与GSMS-TACE术前比较均有统计学差异（P＜0.05）（见表2）。

表2 15例大肝癌患者GSMs-TACE治疗前后外周血Treg细胞含量比较

2.3 肝癌患者GSMs-TACE治疗前后影像学改变

GSMs-TACE术中DSA造影显示肝内肿瘤染色，供血动脉来来自肝右动脉。GSMs-TACE术后阻断肿瘤供血动脉，再次造影可见肿瘤染色消失（见图1）。肝癌患者介入术后第4天复查上腹部CT平扫，结果显示15例HCC患者肝内肿瘤均有不同程度蜂窝状坏死（见图2）。

2.4 肝癌患者GSMs-TACE治疗前后外周血Treg细胞流式检测图

GSMs-TACE治疗后Treg细胞含量明显升高，术后10 d下降至最低水平，术后22 d又现升高，但仍低于术前水平（见图3）。

3 讨论

图1 大肝癌患者GSMs-TACE术中DSA造影

图2 同一例患者手术前后影像学检查

图3 同一例患者GSMs-TACE治疗前后外周血Treg细胞含量流式检测图

当肝癌发生后，机体T淋巴细胞在肿瘤免疫中起调控及免疫监视作用。Treg细胞参与机体免疫系统对自身抗原形成免疫耐受，由于大多数肿瘤抗原属于自身抗原，机体对早期原发肿瘤一般处于免疫无反应状态，而这种肿瘤免疫耐受的形成与Treg细胞存在一定关系［7］。另外，Treg细胞一旦被激活，可通过抗原非特异方式抑制CD4+T细胞和CD8+T细胞，从而抑制T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用［8］。

已有研究证实，HCC患者外周血中Treg细胞较正常人显著上升，从肿瘤免疫学角度证实HCC的发生机制［9］。本研究对比HCC患者与健康人外周血中Treg细胞的含量，同样支持上述结论。TACE方法虽然是作为无手术切除适应证HCC有效治疗方法，广泛应用临床实践，但多次治疗仍有部分患者获得完全缓解，疗效机制可能与治疗前后机体肿瘤免疫功能状态相关。已有研究证实，cTACE术后患者外周血CD4+CD25+/CD4+T细胞的比例较治疗前（11.12±3.58）%，显著下降至（7.58±2.65）%［5］。

GSMs-TACE相对传统cTACE，在肝功能和肝储备功能良好前提下，彻底栓塞肿瘤供血动脉，术后肿瘤呈现蜂窝状坏死改变，肿瘤负荷短时间内大量减少，同样表现在如HCC特异性肿瘤标记物AFP数值显著下降。前期研究证实，GSMs-TACE方法多次治疗巨块型肝癌，术后6个月完全缓解率为25%，而且TACE治疗间隔平均时间为2.6个月［6］。探讨上述临床现象的原因，除充分闭塞肿瘤供血动脉以阻断其营养来源外，是否也存在肿瘤呈显著蜂窝状坏死病理改变，肿瘤负荷短时间内大量减轻，进而对机体免疫功能有正向调节作用，这方面研究还未见报道。

本研究观察术后10、22 d外周血中Treg细胞含量的变化，发现术后10 d Treg细胞含量为（9.07±1.94）%，较术前（11.52±3.78）%显著下降，表明肿瘤负荷的显著下降有助于改善机体免疫功能状态。继续观察术后 22 d Treg细胞含量为（9.96±1.48）%，仍低于术前基线水平，但较术后10 d数值略有升高。GSMs-TACE术后外周血Treg细胞的含量先下降后升高可能是肝肿瘤介入术后出现的液化坏死，在短时间内可能不会导致肿瘤进展，但由于是晚期大肝癌，残存的肝癌细胞继续生长，通过多种作用机制，从而导致外周血中的Treg细胞的含量再次升高。上述研究结果可以初步得出2个基本结论：①外周血中Treg细胞在GSMs-TACE治疗后，肿瘤大范围坏死，肿瘤负荷显著减轻，术后10 d是外周血Treg细胞最低值，可能是适时给予免疫辅助治疗的最佳时机；②机体免疫功能改善可以在1个月内持续保持，但可能随着肿瘤细胞的进一步增殖，机体免疫功能又逐渐恢复抑制状态，包括GSMs-TACE在内的肿瘤后续治疗方法要随后进行，进一步减轻肿瘤负荷，以更好恢复和提升机体抗肿瘤的免疫能力。

本研究入组患者例数较少，初步观察GSMs-TACE治疗HCC对外周血中Treg细胞含量影响，初步证实该方法对机体免疫功能可能存在正向调节作用。拟进一步扩大HCC数量，观察疗效与外周血中Treg细胞相关性，从Treg细胞角度，更加深入探讨GSMTACE对机体免疫功能影响，从肿瘤免疫学角度探讨GSMs-TACE方法治疗HCC，尤其是大肝癌的疗效机制。