靶向Plac1基因小分子干扰RNA的筛选及对肝癌细胞功能的影响

吴 瑗，王 欣，赵汉宁

(广东医科大学微生物学与免疫学教研室，广东湛江 524023)

原发性肝癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。尽管肝癌的诊断和治疗获得了很大的提高，但预后仍欠佳，侵袭转移是肝癌术后复发、疗效差的主要原因[1-2]。因此，探讨肝癌侵袭转移的机制，寻找肝癌复发转移预测标记及干预治疗靶点，显得尤为重要。胎盘特异基因1(placenta-specific 1，Plac1)最初被认为是胎盘特异表达的新基因，人Plac1基因定位在Xq26.3，全长92 641 bp，含3个外显子，第3外显子为编码区，共编码212个氨基酸，在正常组织中的表达主要局限于胎盘，参与调控胎盘的生物学功能[3-4]。但目前越来越多的研究表明，Plac1在肿瘤的发生、发展中发挥重要的作用。有实验证实， Plac1在乳腺癌、前列腺癌、胃癌等多种肿瘤组织高表达，并且与肿瘤的侵袭转移存在一定关系[5-7]。也有研究者发现，Plac1在肝癌细胞及肝癌组织中的表达水平也上调[8]，但其在肝癌中具体的作用机制未明确。本实验应用RNA干扰技术，设计构建3条Plac1基因的小分子干扰RNA(siRNA)序列，旨在筛选出最为有效的序列，为进一步研究Plac1在肝癌的作用机制提供可行的工具，为后续实验研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验细胞 细胞L02、HepG2、Bel-7402、SMMC-7721及Huh7购自中国科学院上海细胞所，HLE细胞株由北京大学医学部尹艳慧教授惠赠。

1.1.2 实验试剂与引物 DMEM培养基及胎牛血清购自美国Hyclone公司，Lipofectamine 2000脂质体及RNA提取试剂Trizol购自美国Invitrogen公司，反转录试剂购自美国Promega公司，定量PCR所用SYBR Green qPCR SuperMix购自美国Invitrogen公司，Plac1抗体购自美国Abcam公司，CCK-8试剂盒购自碧云天公司。由美国Sigma公司设计及合成针对Plac1的基因序列，3条Plac1-siRNA和1条阴性对照(NC-siRNA)序列见表1。

表1 Plac1-siRNA及NC-siRNA序列

1.2 方法

1.2.1 细胞培养与转染 L02、HepG2、Bel-7402、HLE、SMMC-7721及Huh7均采用 DMEM培养基(含10%胎牛血清)，37 ℃ 5% CO2培养。待HepG2细胞处于对数生长期进行转染，转染前1 d按5×104个/孔将细胞接种于24孔板中，贴壁细胞融合率达40%时进行转染。取20 μmol/L siRNA 10 μL溶于500 μL opti-MEM中，混匀，静置(A管)。将5 μL Lipofectamine 2000加入500 μL opti-MEM中，轻轻混匀，静置不超过5 min(B管)，将A管和B管混合，混匀，静置20 min；然后分别加入各孔中，混匀后放入细胞培养箱，4～6 h后，吸去转染培养基，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗两遍，每孔加入2 mL完全培养基，转染24 h后用定量PCR检测siRNA的基因干扰效率。实验分为3组：实验组、阴性对照组、空白对照组，其中实验组为转染Plac1-siRNA组，阴性对照组为转染NC-siRNA组，空白对照组为仅加入转染混合液。

1.2.2 实时定量PCR(qPCR)检测Plac1 mRNA的表达 按照Trizol试剂盒提取细胞总RNA，然后检测总RNA纯度和完整性，反转录成cDNA，应用以下引物进行qPCR检测。PLAC1-F1：5′-TAA GGG CAC GCC ATC TAA GT-3′，PLAC1-R1：5′-GGA CTG TGA CAA GCT GAA CAC-3′；18srRNA-F：5′-CCT GGA TAC CGC AGC TAG GA-3′，18srRNA-R：5′-GCG GCG CAA TAC GAA TGC CCC-3′。反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 32 s，读板，40个循环，每个样品重复3次。

1.2.3 蛋白质印迹法(Western blot)检测Plac1蛋白的表达 收集细胞后提取总蛋白并测定水平，将待测蛋白样品与上样缓冲液充分混匀后煮沸10 min，定量上样并进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，于4 ℃进行印迹电转移，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加入一抗，4 ℃过夜，洗涤后加入二抗，室温避光孵育2 h。洗涤后将化学荧光发光底物均匀地加到膜的表面，并使反应持续5 min。用滤纸吸去膜表面多余的底物溶液，放至暗盒，显影，扫描及分析。Plac1的灰度值与3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)灰度值计算相对比值。

1.2.4 细胞增殖及迁移能力的检测 采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖能力，消化细胞后吹打散细胞，计数，调整细胞浓度为1×105个/毫升，分到96孔板，每孔100 μL，即每孔细胞为1×104个。待细胞贴壁后，再收集各个时间点的细胞(0、24、48、72 h)加入CCK-8溶液，比例为1∶10，即100 μL培养液加入10 μL检测液。孵育4 h后，酶标仪测定各孔450 nm处吸光度(A450) 值，每孔复测3次，取结果的平均值。

1.2.5 细胞迁移能力的检测 采用美国BD公司Transwell小室，取对数生长期细胞，计数1×105个/毫升，用100 μL无血清培养基重悬，加入Transwell细胞培养板的小室上室，在下室加入600 μL完全培养基。 在37 ℃ 5% CO2孵育48 h后，取出小室，用棉签擦去上室的细胞，4%多聚甲醛固定20 min，PBS洗涤1次，结晶紫染色10 min，PBS洗涤1次，显微镜下观察并拍照。

2 结 果

2.1 Plac1在多种肝癌细胞中的表达 qPCR结果显示，Plac1 mRNA在正常肝细胞L02的表达水平较低，而在HLE、SMMC-7721、Huh7、Bel-7402及HepG2等肝癌细胞的表达水平均明显高于正常肝细胞L02(P<0.05)，见图1；Western blot结果显示，Plac1蛋白在肝癌细胞中高表达。在上述5种肝癌细胞中，HepG2细胞的Plac1 mRNA及蛋白表达水平最高，故选取HepG2细胞作为目的细胞进行siRNA干扰沉默Plac1基因，开展后续的实验。

A：Plac1 mRNA在肝癌细胞与正常肝细胞的表达；B：Plac1蛋白在肝癌细胞与正常肝细胞的表达；1：HLE；2：SMMC-7721；3：Bel-7402；4：L02；5：Huh7；6：HepG2；*：P<0.05，与L02比较

图1 Plac1在肝癌细胞与正常肝细胞的表达

2.2 筛选沉默Plac1基因的siRNA 为了有效沉默Plac1基因，针对Plac1基因序列设计了3条siRNA，应用qPCR筛选最佳序列，结果显示：3条siRNA序列转染HepG2细胞后，Plac1-siRNA1、Plac1-siRNA2及Plac1-siRNA3组的Plac1 mRNA表达水平均下调，与NC-siRNA组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；而空白对照组与NC-siRNA组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。3条序列中以Plac1-siRNA1的抑制作用最强，其抑制率达到96%，故选取siRNA-1用于后续实验。

*：P<0.05，与NC-siRNA组比较

图2 Plac1 mRNA在肝癌细胞HepG2的表达

2.3 siRNA-1抑制肝癌细胞Plac1蛋白的表达 Western blot结果显示，Plac1在HepG2细胞的空白对照组与NC-siRNA组的表达较高，而在Plac1-siRNA1组的表达明显下调(图3A)。对Western blot蛋白条带进行灰度扫描后分析，结果显示HepG2细胞Plac1-siRNA1组的Plac1/GAPDH比值明显低于NC-siRNA组，差异有统计学意义(P<0.05)，其比值下调95%；NC-siRNA组与空白对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见图3B。此结果与q-PCR的结果相吻合，进一步验证了siRNA1确实可有效沉默Plac1基因。

A：Western blot检测Plac1在HepG2细胞的表达；B：HepG2细胞Plac1蛋白的相对表达水平；1：空白对照组；2：NC-siRNA组；3：Plac1-siRNA1组;*：P<0.05，与NC-siRNA组比较

图3 Plac1蛋白在HepG2细胞的表达

2.4 siRNA1沉默Plac1后对肝癌细胞增殖及迁移能力的影响 Plac1-siRNA1转染HepG2细胞后，CCK-8法检测其对细胞增殖的影响，结果显示培养24、48及72 h后，Plac1-siRNA1组的细胞增殖活性均下调，与NC-siRNA组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；而空白对照组与NC-siRNA组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，其中以转染72 h的抑制效果最为显著，见图4A。Transwell实验结果显示，与空白对照组及NC-siRNA组比较，siRNA1沉默Plac1后可以明显抑制HepG2细胞的迁移能力(图4B)。

A：细胞增殖；B：细胞迁移(×200);*:P<0.05,与NC-siRNA组比较

图4 Plac1影响肝癌细胞增殖及迁移能力

3 讨 论

随着深入的研究，Plac1在肿瘤的作用被不断证实，研究显示其属于癌-睾丸(cancer-testis，CT)抗原，在多种肿瘤细胞株(如宫颈癌、结肠癌、肝癌、前列腺癌、黑色素瘤、多发性骨髓瘤、绒毛膜癌和神经母细胞瘤等)呈高水平表达[9]，并且在肝癌、胃癌、乳腺癌、肺癌及前列腺癌等多种肿瘤组织的表达水平也高于正常组织[5-8，10]。有研究显示，Plac1的表达水平与胃癌及胰腺癌的生存期呈负相关[7，10]，与前列腺癌Gleason评分呈正相关[6]，Plac1可能成为判断肿瘤预后的标志物之一。另有不少的研究表明，Plac1具有免疫原性，可以诱导免疫应答，从而起到抗肿瘤的作用，因此可作为肿瘤免疫治疗的靶点[7-8，11]。本研究结果显示，5种肝癌细胞HepG2、Bel-7402、HLE、SMMC-7721及Huh7的Plac1表达水平均明显高于正常肝细胞，预示Plac1的异常表达可能参与肝癌的发生、发展，但其具体作用机制仍未明确。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)是目前较为有效的基因表达沉默技术，已经成为研究基因功能和疾病基因治疗的重要工具，其利用siRNA对同源序列mRNA进行识别并降解，从而导致特定基因减效表达或不表达[12]。为研究Plac1在肝癌发生、发展中的作用，本研究针对Plac1基因设计3条siRNA序列，成功筛选了有效沉默Plac1的siRNA1序列，从而为进一步探讨Plac1在调控肿瘤形成、复发、转移中的作用提供了研究工具。有文献报道沉默Plac1基因后，乳腺癌细胞的增殖降低，细胞生长停滞在G1/S期，进一步研究发现Plac1基因沉默所致的细胞周期失调与周期蛋白D1(Cyclin D1)及磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路有关，而且沉默Plac1基因可显著降低乳腺癌细胞的趋化迁移和侵袭能力[5]。为探究沉默Plac1能否影响肝癌细胞的生物学功能，本研究初步的体外细胞生物学功能研究发现，siRNA1沉默Plac1后，肝癌细胞HepG2的增殖能力及迁移能力均显著低于空白对照组。由此可见，Plac1很有可能通过调控肝癌细胞的生物学行为促进肿瘤的发生、发展，其具体机制有待进一步的深入研究。

综上所述，本研究针对Plac1基因序列，筛选出具有特异性沉默Plac1表达的干扰序列，并且此序列有效抑制了Plac1的功能，为进一步研究Plac1基因功能及细胞生物学行为奠定了基础。