真空冷冻干燥法制备微生态制剂及其对肉牛养分表观消化率的影响

■高堂亮 沈思军 潘晓亮王新峰

（石河子大学动物科技学院，新疆石河子832000）

新疆牧区肉牛生产充分利用天然的草场优势，夏秋季节多采用放牧方式，而春冬季节转移到农作物秸秆、农副产品丰富的农耕区饲养，却使肉牛瘤胃微生物区系发生改变[1]，而据赵晨旭[2]、Douglas LC 等[3]和Ye G等[4-5]研究报道表明，微生态制剂具有瘤胃调控作用，因此本研究以地衣芽孢杆菌（Bacillus lichenifor⁃mis，BL）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，BS）和植物乳酸菌（Lactobacillus plantarum，LP）为主要菌种，采用真空冷冻法，期待研制出一种活菌高、质量稳定的微生态制剂，调节肉牛胃肠道平衡、促进瘤胃微生物的健康生长和帮助建立正常的瘤胃微生物菌群等，以期在农耕区的肉牛能够快速适应环境并提高养分表观消化率展开相关试验，为微生态制剂在肉牛生产中的应用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验菌种

BS和LP，均来源于石河子大学饲料生物技术实验室，BL购自中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)。

1.1.2 主要试剂及培养基

丙三醇(甘油)、氯化钠(化学纯)、碳酸钙、葡萄糖、无水硫酸铜等均购自于新疆沃德生物科技公司。

BS和BL用培养基：营养肉汤(购自青岛海博生物技术有限公司)，准确称取18 g，加热溶解于1 000 ml蒸馏水中，分装后121℃，高压灭菌15 min，备用；营养琼脂(购自青岛海博生物技术有限公司)，准确称取33 g，加热溶解于1 000 ml蒸馏水中，分装后121℃，高压灭菌15 min，无菌操作倾倒平板，凝固后放冰箱冷藏备用；LP用培养基：MRS肉汤(购自北京陆桥技术有限责任公司),准确称取52.4 g，加热溶解于1 000 ml蒸馏水中，分装后115℃，高压灭菌15 min，备用；MRS琼脂(购自北京陆桥技术有限责任公司),准确称取66.2 g，加热溶解于1 000 ml蒸馏水中，分装后115℃，高压灭菌15 min，无菌操作倾倒平板，凝固后放冰箱冷藏备用。

1.2 主要仪器设备

电子天平(AL204)、冰箱(BCD-256KF)、Thermo超低温冰箱、高压灭菌锅(MLS-3750)、恒温鼓风干燥箱(GZX-9246MBE)、数显式电热恒温水浴锅（XMTD-204)、超净工作台(SW-CJ-IFD)、数显恒温培养箱(DHP-9082)、数显恒温振荡培养箱(LRH-250-A)、Thermo高速冷冻离心机、液氮罐与TELSTAR真空冷冻干燥机(LYOQUEST-85)、722型可见光分光光度计、菌落计数器(XK97-A)、FOSS自动凯氏定氮仪、索氏提取器、茂福炉等。

1.3 试验方法

1.3.1 微生态制剂制备方法

采用真空冷冻干燥法制备。按菌种活化、传代、扩繁和菌液的浓缩、预冻等处理后真空冷冻干燥及活菌数检测等主要制备步骤进行。

1.3.1.1 菌种活化、传代和种子液制备

菌种活化和传代：从-80℃冰箱中分别取出一管BS、LP和 BL菌种，室温下解冻后，在无菌操作台中，用酒精棉球擦拭手指和试管口处，用灭过菌的接种环分别挑取一环BS和BL接种到装有营养琼脂的培养皿中，LP接种到MRS琼脂的培养皿中，贴上封口膜，标记上菌种名称和日期。然后把BS和BL培养皿倒置，放在37℃恒温培养箱中，培养24 h，LP培养皿倒置后，放在35℃恒温培养箱中，培养20 h，取出后，再分别挑取一环长势较好的菌，传代2～3次，4℃保存备用。

种子液制备：在活化后BS和BL中，分别挑取一环接种到装有10 ml营养肉汤的三角瓶，LP接种到10 ml MRS肉汤的三角瓶中，封口后BS和BL放置在37℃恒温震荡培养箱中，200 r/min过夜培养20 h，LP放在35℃恒温震荡培养箱中，160 r/min过夜培养16 h，取出后，即可获得BS、BL和LP种子液，4℃保存备用。

1.3.1.2 二级菌液的制备、预处理和真空冷冻干燥

二级菌液的制备：用移液枪分别吸取8 ml BS和BL种子液，按8%的接种量接种到装有100 ml营养肉汤的三角瓶中，37℃、200 r/min恒温震荡培养24 h；吸取6 ml LP种子液，以6%接种量接种到装有100 ml MRS肉汤的三角瓶中，35℃、160 r/min恒温震荡培养20 h，4℃保存备用。

二级菌液的预处理及真空冷冻干燥：BS、BL和LP二级菌液在4 500 r/min下，4℃离心10 min，去掉上清液，获得BS、BL和LP菌体。分别添加无菌的麸皮、葡萄糖、碳酸钙等保护剂混合后，-196℃液氮罐中预冻2～3 min；在0.01 mbar的真空压力下，-85 ℃真空冷冻10～20 h，即可制成BS、BL和LP冻干菌粉。

活菌数检测及产品制备：

①BS计数：无菌操作准确称取BS冻干菌粉1 g，加入9 ml灭菌生理盐水中，振荡混匀，为10-1倍稀释，再取10-1倍稀释液1 ml加入9 ml灭菌生理盐水中混匀，为10-2倍稀释，依次稀释成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9，然后用移液枪分别吸取10-7、10-8、10-9三个稀释度的菌液1 ml到培养皿中，再倒入50℃营养琼脂培养基，轻轻滑动培养皿使得菌液和培养基混合均匀，每个稀释度设置三个重复，凝固后于37℃恒温培养箱中倒置培养24 h，观察计数。计数公式:

BS活菌数(CFU/g)=菌落数的平均值×稀释度

②BL计数方法同BS。

③LP计数：无菌操作准确称取LP冻干菌粉1 g，加入9 ml灭菌生理盐水中，振荡混匀，为10-1倍稀释，再取10-1倍稀释液1 ml加入9 ml灭菌生理盐水中混匀，为10-2倍稀释，依次稀释成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9，然后用移液枪分别吸取 10-7、10-8、10-9三个稀释度的菌液10 μl，点种到装有MRS琼脂的培养皿中，每个稀释度设置三个重复，干燥后于37℃恒温培养箱中倒置培养20 h，观察计数。计数公式:

LP活菌数(CFU/g)=菌落数的平均值×稀释度×100

④微生态制剂产品的制备：将冻干计数的BS、BL和LP按照2∶2∶1的比例混合均匀，密封包装后，放置在低温干燥处，避光保存备用。

1.3.2 表观消化率测定方法

1.3.2.1 试验动物及饲粮

在新疆皇牛畜产品发展有限公司肉牛场随机选取健康、月龄和体重[(284.9±19.33)kg]相近的本地土牛和伊犁褐牛杂交代公肉牛20头。饲粮为全混合日粮(TMR)，其组成及营养水平见表1，精料补充料见表2。

表1 TMR组成及营养水平(饲喂基础)(%)

表2 精料补充料组成及营养水平(风干基础)(%)

1.3.2.2 试验设计与饲养管理

按照日龄和体重（284.9±19.33）kg相近的原则，试验将20头公肉牛，随机分对照组(CG)和试验组(TG)，每组10个重复，每个重复1头，组间初始体重差异不显著。CG饲喂TMR；TG在TMR添加微生态制剂（主要复合菌比例为BL∶BS∶LP=2∶2∶1），晨饲时与少量的TMR均匀混合后单槽饲喂，每天一次，一次性喂完，保证每头牛食入益生菌总数为5×1010CFU/(头·d)。预试期7 d,正试期30 d。

试验肉牛均栓系饲养，自由采食，每天05:30、12:30和19:30各饮水1次。试验条件下，微生态制剂必须每日饲喂，试验从2017年6月25日到2017年7月31日在新疆皇牛畜产品发展有限公司肉牛场进行。

1.3.2.3 饲粮和粪便样品采集与测定

在试验期内，根据国标法(GB/T 14699.1—2005)中《饲料采样法》采集饲粮(精料补充料单独采集)粉碎后样品800 g，按“四分法”减少到200 g，共采集5 d，分装于样品袋中，标注样品信息，保存于-20℃冰箱中，待5 d样品采集一起混合，晾干制样，常温保存待测；

正试期内最后5 d，连续收集5 d的粪样，每组收集4头，每头不少于200 g，加入10%稀盐酸进行固氮，-20℃保存。试验结束后，将粪样混合均匀，65℃烘干至恒重，粉碎后过40目筛，待测。

用内源指示剂[盐酸不溶灰分(AIA)]法测定饲粮各养分的消化率。饲粮和粪便中干物质(DM)含量参照GB/T6435—2006方法测定，粗蛋白质(CP)含量使用FOSS-2300自动凯氏定氮仪测定，粗脂肪(EE)含量采用索氏提取法测定，中性洗涤纤维(NDF)含量采用GB/T20806—2006方法测定，酸性洗涤纤维(ADF)含量采用NY/T1459—2007法测定，盐酸不溶灰分(AIA)参照GB/T 23742—2009/ISO 5985:2002。养分表观消化率计算公式如下：

1.4 数据统计与分析

用Excel 2013对数据进行初步整理后，使用SPSS 13.0软件进行统计分析，采用独立样本法进行差异显著性检验，结果以“平均值±标准差(mean±SD)”表示，其中P＜0.05为差异显著。

2 结果

2.1 真空冷冻干燥法制备微生态制剂(见表3)

由表3可知，真空冷冻干燥法制备BS、LP和BL菌粉的活菌量≥1.35×1010CFU/g，且显著高于原菌液的活菌量(P＜0.05)。

2.2 微生态制剂对肉牛养分表观消化率的影响(见表4)

由表4可知，TG的DM、CP、EE、NDF和ADF表观消化率均高于CG，且DM的表观消化率显著高于CG(P＜0.05)。

表4 微生态制剂对肉牛养分表观消化率的影响(%)

3 讨论

3.1 真空冷冻干燥法制备微生态制剂

活菌含量的高低是评定微生态制剂质量的关键因素，而目前真空干燥、喷雾干燥和真空冷冻干燥制备方法中，真空冷冻干燥因干燥后物质体积、形状基本不变，无干缩且能除去物质中95%～99%的水分，有利于长时间保存等优点被广泛应用。冻干法原理是将物质中的水分冻结成冰后，在真空下使冰晶直接升华而达到干燥的目的[6]。山丽杰[7]研究发现，利用真空冷冻干燥技术制成的酸奶发酵剂冻干粉，活菌量≥1×1010CFU/g，崔树茂[8]和王昕悦[9]研究都验证了这一结果。本试验结果与前人研究结果基本一致，采用真空冷冻干燥法制成的BS、BL和LP冻干粉，活菌量≥1.35×1010CFU/g。

3.2 微生态制剂对肉牛养分表观消化率的影响

通过接种有益微生物除了建立正常微生物区系来调节胃肠道平衡和维持机体健康[10-11]外，LP具有较强的产酸功能和芽孢杆菌具有蛋白酶、淀粉酶、细胞壁裂解酶、透明质酸酶、β-1,2葡萄糖苷水解酶和半纤维素酶等酶活功能[12-13]，不仅为机体提供营养，还能提高养分的消化率[14-15]。Qiao等[16]使用地衣芽孢杆菌培养物饲喂荷斯坦奶牛，显著增加了瘤胃内中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维和有机物质的表观消化率(P＜0.05)。李光梅等[17]研究指出，在青海细毛羊饲粮中微生态制剂冻干粉（主要含乳酸菌、芽孢杆菌和双歧杆菌），可以显著提高细毛羊DM、CP、EE和CF消化率(P＜0.05)，王有丰等[18]研究也证实了这一结果。王建国等[19]和杨朋飞[20]研究表明，饲粮中添加微生态制剂可以显著提高奶牛DM、CP消化率，并可以改善NDF的消化能力。本试验结果与前人研究结果一致，饲粮添加微生态制剂后，TG的养分表观消化率与CG相比均有不同程度的提高，其DM表观消化率显著提高(P＜0.05)，CP、EE、NDF和ADF表观消化率分别提高了1.18%、0.83%、2.32%和2.48%。

4 结论

①本试验采用真空冷冻法制备微生态制剂的活菌量≥1.35×1010CFU/g。

②饲粮中添加含量为5×1010CFU/(头·d)的微生态制剂，可以显著提高肉牛DM表观消化率，改善CP、EE、NDF和ADF的消化能力。