犬发情期血清孕酮水平与最佳配种时间测定

张斌 历可 周红蕾 卓国荣 武彩红

（江苏农牧科技职业学院 225300）

犬的发情是指犬在达到性成熟后在一些激素的作用下出现生理和行为的周期性变化。在繁殖学上讲，犬是季节性单次发情动物或者双次发情动物[1]正常情况，母犬一般一年发情两次，母犬发情的标志是阴道流血，阴道流血正常情况下会持续21d左右[2]。每次发情间隔约6个月左右，单养犬多数在春秋两季发情 （3～5月，9～11月）。根据犬的不同性生理变化，把犬性周期分为4个阶段，即乏情期、发情前期、发情期、发情间期[3]。

法国斗牛犬发情期季节性较明显，一般春秋两季各一次，少数法国斗牛犬一年只发情一次，有的发情3次。法国斗牛犬发情期主要表示为阴门水肿，血性分泌物，接受爬跨交配。法国斗牛犬最初发情可出现在7～8月龄，发情期平均9～12d，发情后期配种率较高，即法国斗牛犬出现血性分泌物后第9～12天若交配极有可能怀孕。

通过孕酮的测定与阴道细胞学检查确定母犬发情与否，以及所处的发情阶段并帮助确定最佳配种时间。

1 实验材料

1.1 实验动物

选取年龄在2～4岁，精神良好，食欲正常，在2017.10～2018.4就诊于泰爱牧教学宠物医院的法斗母犬共16例。就诊主要检测犬发情期变化及孕酮测定。

1.2 实验仪器及材料

麦克奥迪显微镜、孕酮检测仪。Diff-quik染液一套，购自上海纳博科临动物临床检验实验室；孕酮检测试剂盒，购自北京德诺泰克科技有限公司。

2 实验方法

2.1 阴道涂片观察

2.1.1 采样

实验犬保定好后，阴道口周围清洁干净，将浸泡过生理盐水的灭菌棉签插入阴道4～6cm，轻轻转动棉签2～3次，以保证棉签能充分接触阴道上皮细胞。

2.1.2 染色

将采集好的棉签阴道内容物均匀涂抹在玻片上，自然晾干，diff-quik染色。首先，将要染色的涂片完全干燥之后放入固定液 （diff-quik A）中10～20s；然后，将涂片从固定液中取出无需冲洗可直接放入diff-quik B染液中染色5～10s，要使diff-quik B染液均匀染色玻片，无需冲洗；最后，将从玻片从diff-quik B液中取出直接放入diff-quik C染液中染色5～10s，要使diff-quik C染液均匀染色玻片。将玻片取出后用生理盐水冲洗去剩下的染液，自然晾干即可，镜检[4]。

2.1.3 镜检观察

每天记录发情母犬血样分泌物颜色及分泌量，阴唇肿胀程度等。显微镜下观察阴道涂片，主要观察角质化上皮细胞的形态、边缘、核膜，并对角质化上皮细胞比例进行统计。

2.2 血清孕酮测定

实验犬保定，剃毛，消毒，前肢头静脉采血2ml，12000r/min离心3min分离，离心提取血清，用移液器抽取50μl血清加入稀释液混合均匀后抽取100μl混合液，滴到试剂卡加样孔上，待混合液从圆孔流到前端空格处，将试剂卡插入荧光仪卡槽内，点击荧光仪屏幕上的 “开始测试”，10min读取检测结果。

3 结果与分析

3.1 阴道涂片细胞形态变化

发情前期 （持续6～11d）：有大量红细胞和副基底上皮细胞出现，发情期继续发展会出现红细胞数量逐渐减少，但上皮细胞会出现角化迹象并且会逐渐增加。到发情前期的晚期时，几乎所有的上皮细胞都会表现为伴有核固缩的中间细胞，也有时会出现少量的嗜中性粒细胞[8](见图1)。

发情期 （持续5～9d）：所有的鳞状上皮细胞为角化状态，一般呈多边形，不规则，角化程度不一，着色情况也不一致。通常无核或有一个 “影核”或者固缩的小核残体；随着发情的持续，至发情配种后时可达到75%以上，发情期结束后会逐渐下降[7]。无中性粒细胞，可能出现少量的红细胞；发情末期时红细胞会持续下降，同时嗜中性粒细胞会急剧上升 （见图2）。

发情间期 （56～60d）：角化的鳞状上皮细胞数量急剧下降，中间细胞和副基底细胞再次出现，嗜中性粒细胞数量的增加，有时可见一些红细胞 （见图3）。

3.2 血清孕酮的结果

3.2.1 血清孕酮水平

本次试验对泰爱牧宠物医院临床孕酮检测的16例法斗母犬进行分析，主述所有犬均处于发情期。按照犬场惯例，首次阴道排血记录为第一天发情。所有犬孕酮测定均在发情第12～14天内检测[5]。所有犬均采用人工授精方式配种，配种时间均在孕酮测定后48h内完成。一个月后回访，编号3、5、8、12犬配种不成功，其他犬只都配种成功。成功率75%。配种成功的犬在发情12～14d检测孕酮值均处25～45ng/ml，配种不成功的犬孕酮均超过45ng/ml。由图表明孕酮测定值在20～40ng/ml时是最佳配种期 （见附表、见图 4）。

图1 发情前期阴道涂片

图2 发情期阴道涂片

图3 发情间期阴道涂片

图4 犬发情期孕酮测定值分布图

4 讨论与分析

4.1 阴道鳞状上皮细胞角化程度可确定配种时间

资料表明，鳞状上皮细胞的角化程度和体内雌二醇和孕酮浓度变化息息相关，雌二醇和孕酮水平的变化决定了鳞状上皮细胞的角化程度[10]。犬在发情开始后的9～12d雌二醇达到峰值，之后逐渐下降，孕酮浓度在发情前期开始后的9～12d也开始升高，在此期间，通过对阴道涂片的连续观察发现，发情母犬随着时间推移，角化细胞数量在逐渐增多，发情后第10～ll天可达80%～90%，可维持2～3d，随后开始逐渐减少消失[6]。因此，可以通过观察阴道上皮细胞的角化程度来大致确定配种时间。

4.2 孕酮测定确定配种时间

孕酮由黄体分泌，属于甾体激素，在排卵、妊娠、分娩、乳腺发育等各方面都发挥着至关重要的作用[9]。孕酮在犬发情前期浓度较低，且上升缓慢，一般维持在1～5ng/ml。孕酮达到5ng/ml时犬一般开始排卵。在发情期，随着雌二醇浓度下降，孕酮浓度会逐渐上升，孕酮浓度达到25～45ng/ml时达到最佳配种时间，孕酮值上升至20ng/ml时可进行第一次配种，48h后可进行第二次配种；孕酮浓度达到25～40ng/ml时建议2～3h后配种，48h后可进行第二次配种，以提高配种成功率。孕酮测定值达到45ng/ml时，说明犬已进入发情后期，不建议配种。

鉴定母犬发情的方法常用阴道涂片和孕酮测定法，每一种方法均有其优缺点[11]。要准确把握犬的配种时间，建议同时使用两种方法一起判断。同时，犬的发情会受到年龄、营养状况、生活环境、光照等多种的条件会影响犬的发情，在生产实践中，应根据犬实际情况综合推断犬最佳配种时间[12]。

附表 犬编号与孕酮结果