促甲状腺素受体在亚临床甲状腺功能减退小鼠心室肌的表达及意义*

白丹 倪菁 雷飞 严喜章 马建梅

(西安医学院临床医学院，陕西 西安710021)

甲状腺功能减退症(hypothyroidism，HT)是内分泌科的常见疾病；亚临床甲状腺功能减退(subclinical hypothyroidism ，SCH)是以促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)水平增高而甲状腺功能正常为特征的代谢性疾病。近年来有研究表明，甲状腺功能减退症(HT)和亚临床甲状腺功能减退(SCH)患者均可发生心脏舒缩功能障碍[1]。而在SCH中仅有促甲状腺素(TSH)升高，甲状腺素水平正常，推测TSH在心脏舒缩功能障碍发生中可能发挥一定的作用。甲状腺外的许多组织及细胞都存在TSH受体(TSHR)，TSH可通过与受体结合在这些组织细胞发挥病理生理作用[2]。Dong等[3]在研究中证实了原代大鼠心肌细胞表面TSHR的表达，而且发现高浓度长时间的TSH作用于心肌细胞表面TSHR能够明显下调钙离子、serca2a、Ryr2蛋白水平，通过对PKA/PLN信号通路的调控机制，影响心脏舒缩功能。本研究旨在探讨TSHR在SCH小鼠心室肌细胞上的表达情况，为亚临床甲状腺功能减退与心脏舒缩功能障碍的关系研究提供客观依据。

1 材料与方法

1.1 SCH动物模型制备 30只7周龄BALB/c小鼠以普通饲料加蒸馏水适应性喂养1周后，随机分为对照组及实验组，每组15只。对照组小鼠饮用正常水。实验组小鼠按照Zhou 等[4]实验建模的方法建立SCH动物模型，具体操作：每日以0.1% 丙硫氧嘧啶(PTU)溶液替代饮水，6周之后，腹腔注射4-苯基丁酸[100mg/(kg·d)](一种经典抑制内质网应激的化学分子伴侣，可改善SCH模型小鼠中TSH介导的内质网应激反应)，注射28天后完成SCH动物模型的制备。对照组腹腔注射等量生理盐水。

1.2 超声心动图检测 实验进行当日各组均经腹腔注射氯胺酮(75mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)麻醉小鼠后，采用超高分辨率多普勒超声诊断仪(Visual Sonics Vevo 2100型，Canada)及相关分析软件进行超声心动图检查，测量数据包括：脉冲多普勒二尖瓣E峰与组织多普勒二尖瓣环E’峰之比值(E/E’)、左室射血分数(LVEF)。

1.3 血清TT3、TT4、TSH水平测定 各组小鼠摘取眼球取血，离心后采集血清，-80℃保存待测。放射免疫分析法检测血清中总三碘甲状腺原氨酸(TT3)、总四碘甲状腺原氨酸(TT4)、促甲状腺激素(TSH)水平。操作严格按照试剂盒说明书进行(TT3、TT4、TSH放射免疫分析试剂盒均购于天津市九鼎医学生物工程有限公司)，抗体及试剂混匀后37℃温育1h，加入分离剂后充分摇匀，室温放置15min。离心前任取两管测量，作为总放射性强度T，3500r/min，留沉淀物测量读数。

1.4 小鼠心室组织TSHR免疫组织化学染色 各组小鼠开胸取出心脏，剪取心室组织，4%多聚甲醛，4℃固定24h。常规乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续切片(切片厚度5μm)，贴附于载玻片上，经脱蜡、脱水、抗原修复、过氧化氢消除内源性过氧化物酶等步骤后，使用TSHR抗体显色试剂盒(购于武汉博士德生物工程有限公司，一抗为兔抗小鼠TSHR多克隆抗体)，加入后4°C过夜，洗涤后再加入二抗，37℃孵育1h，洗涤；加入显色液。按步骤进行染色后，光镜下观察染色结果。阴性对照以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗。

2 结果

2.1 两组超声心动图检测结果 实验组E/E’值高于对照组(P<0.01)；两组LVEF比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 各组超声心动图检测结果比较Table 1 Echocardiography results in the groups

2.2 两组血清TT3、TT4、TSH水平 两组TT3水平比较差异无统计学意义(P>0.05);实验组血清TT4水平低于对照组;血清TSH水平明显高于对照组(P<0.01)，见表2。提示实验组小鼠造模成功。

表2 各组血清TT3、TT4、TSH水平比较Table 2 TT3, TT4 and TSH serum levels in the groups

2.3 两组小鼠心室肌细胞TSHR免疫组织化学染色情况 光镜下观察各组小鼠心室肌细胞TSHR免疫组织化学染色情况，可见阳性染色为棕黄色颗粒。实验组TSHR表达明显高于对照组，见图1。

3 讨论

众多研究表明甲状腺功能减退可导致多种心脏疾病的发生。甲状腺功能减退即甲状腺素的合成或分泌减少或者是分泌的甲状腺素生物效价降低[5-6]，而甲状腺素可以通过影响心肌组织细胞内的钠-钾-ATP 酶的活性及影响HMG-CoA 还原酶(HMGCR)的合成从而使甘油三酯的清除率下降等一系列机制从而引起心脏传导功能异常诱发心律失常或者加重冠状动脉粥样硬化，增加冠心病的患病率；还可以通过调节蛋白合成的变化来影响心肌肌凝蛋白ATP 酶的活性和功能，从而直接影响心肌收缩力和心排血量，导致冠脉痉挛、心肌缺血等[7-9]。

图1 各组小鼠心室肌细胞TSHR免疫组织化学染色结果(×200)Figure 1 Results of TSHR immunohisto-chemical staining in ventricular myocytes of micein each group注：A. 阴性对照组；B. 对照组；C.实验组

除了甲状腺功能减退引起心脏舒缩功能改变外，近年来关于亚临床甲状腺功能减退(SCH)对心血管系统的危害也逐渐被人们所认识。在出现SCH时，心脏前负荷显著减低，后负荷增加，心输出量及每搏输出量减少，影响左室舒张功能、损伤血管内皮功能、增加C反应蛋白(CRP)水平，从而增加冠心病和心力衰竭发生的风险[10-12]。近几年国内外学者对高水平TSH与心脏功能之间相关性进行了大量研究，高水平的TSH可严重影响肥厚性心肌病患者左心室的舒张功能[13-16]。研究表明在充血性心力衰竭患者中SCH和心衰的发生呈正相关，但在正常人群中则无[16]。除此之外，也有研究表明老年女性动脉粥样硬化和心肌梗死的发生与SCH有关[17]。

HT和SCH患者均可发生心脏舒缩功能障碍，而在SCH中仅有TSH水平升高，甲状腺素水平正常，提示亚甲减时升高的血清TSH对心脏的舒缩功能改变有一定的影响。甲状腺外的许多组织及细胞都存在TSH受体，TSH可通过与受体结合在这些组织细胞发挥病理生理作用。已有研究证实TSH受体存在于血管内皮细胞和平滑肌细胞，并发挥一定作用。TSH可通过直接作用于内皮细胞促进内皮素、纤溶酶原激活物抑制物-1等的分泌，作用于平滑肌细胞促进平滑肌细胞发生表型转换从而促进动脉粥样硬化的发生[19-20]。大量实验研究表明TSH受体存在于眶后成纤维细胞[21]，但对于TSHR是否也存在于心肌细胞的相关研究较少。

本研究发现，经过亚临床甲状腺功能减退造模的实验组小鼠，超声心动图检测结果提示实验组小鼠心功能受损。实验组血清TT4水平明显低于对照组，血清TSH水平明显高于对照组(P<0.01)，提示实验组小鼠造模成功。本研究应用免疫组织化学染色法结果提示心室肌组织中存在一定的TSHR表达，当亚甲减发生时，心室肌组织中的TSHR表达上调。黄雯[22]在相关研究中探讨了心室肌TSHR表达上调的具体机制及功能，通过体内、外试验证实TSH可通过cAMP/PKA/CREB信号通路上调心室HMGCR，并在一定程度上促进心室肌TSHR的表达、上调心室肌细胞分泌BNP，在甲减相关性心力衰竭的发生发展中发挥重要作用。而目前对SCH的研究报道中普遍发现TSH受体功能缺失或者等位基因失活性突变是引起SCH的主要原因。但是结合本文实验研究推测：是否可能存在其他的作用机制，即在SCH患者中，TSH的增加所导致的TSH受体的增加不仅可能存在受体功能缺失型变异，也有可能是受体密度或数量的增加，高浓度的TSH与心肌组织中增加的TSH受体结合从而影响心脏的功能。因此，对增加的TSH受体活性的测定以及结合后如何影响心肌组织的作用机制方面将是我们进一步研究和探索的方向。

4 结论

当发生亚临床甲状腺功能减退时，高浓度的TSH可通过与心室肌组织中高表达的TSHR结合并影响心脏舒缩功能。