苹果原花色素提取分离及其抗氧化作用

(上饶师范学院 生命科学学院，江西 上饶 334001)

我国是全球最大的苹果生产国[1]，苹果中含有丰富的糖类、维生素、矿物质及多酚类物质[2]。苹果中的多酚类物质主要是原花色素。原花色素又称缩合单宁或缩合鞣质，由黄烷-3-醇单体缩合而成，也是近年来不断研究和开发的一种生物活性物质[3-4]。经过药理研究证实原花色素具有抗氧化 、抗痨 、抗突变 、抗真菌 、抗腹泻、抗过敏及降低毛细血管通透性等多种功能[5-6],在医药、保健品和化妆品等领域具有广泛的应用价值[7]。

目前，国内外对苹果原花色素的研究主要集中在原花色素的提取条件[8-10]，而关于苹果原花色素分离及其抗氧化作用的文献较少[11]，特别是采用大孔吸附树脂分离苹果原花色素的研究更少[12]。本研究优化了苹果原花色素的提取工艺，并采用大孔吸附树脂对苹果原花色素粗提液进行分离，比较分离前后苹果原花色素对超氧阴离子自由基的清除率，分析分离操作对苹果原花色素抗氧化作用的影响，为进一步开发利用苹果原花色素提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

市售红富士苹果；儿茶素标准品(≥98%,质量分数)；D101、AB-8、HPD100大孔吸附树脂；其他试剂均为国产分析纯；NL104型电子天平；UV-2102型紫外可见光光度计。

1.2 试验方法

1.2.1 苹果原花色素含量测定及提取率计算

以儿茶素标准品为对照，采用香草醛-盐酸法[13]绘制标准曲线，建立线性回归方程。根据标准曲线计算所得的线性回归方程为：y=2.482 9x+0.020 8(r=0.998 3)，线性范围为0～0.40 mg/mL。

提取液中苹果原花色素含量的测定及提取率计算。准确吸取苹果原花色素提取液1mL，按标准曲线绘制方法操作，测定其吸光度，由线性回归方程计算提取液中苹果原花色素含量，并按式(1)计算苹果原花色素的提取率(%)。

(1)

式中C为提取液中苹果原花色素的含量(mg/mL)，V为提取液体积(mL)，W为苹果质量(g)。

1.2.2 苹果原花色素提取工艺流程

准确称量去皮苹果10 g，研磨充分，加入一定体积的乙醇溶液，在一定温度下回流一定时间，四层纱布过滤，弃渣，滤液用相应浓度的乙醇溶液定容至100 mL，按1.2.1测定其中苹果原花色素含量，计算苹果原花色素提取率。

1.2.3 苹果原花色素提取条件单因素和正交试验

以苹果原花色素提取率为参考指标，分别考察乙醇浓度(体积分数，下同)、料液比、提取时间、提取温度等因素对苹果原花色素提取率的影响；再在单因素试验基础上进行4因素3水平正交试验，优化苹果原花色素的提取工艺。每组试验重复三次。

1.2.4 三种大孔吸附树脂对苹果原花色素静态吸附与解吸效果比较

D101、AB-8、HPD100等三种大孔吸附树脂按文献[14]进行预处理。准确称取三种大孔吸附树脂各5.0 g于锥形瓶中，分别加入按最佳提取工艺条件提取的苹果原花色素提取液50 mL，室温下100 r/min振荡24 h，过滤，按1.2.1测定滤液中原花色素含量，按式(2)分别计算三种树脂的吸附率(%)。

将上述三种吸附后的大孔吸附树脂各四份分别置于锥形瓶中，每种大孔吸附树脂分别加入25%、50%、75%、100%的乙醇溶液50 mL，室温下100 r/min振荡24 h，过滤，按1.2.1测定滤液中原花色素含量，按式(3)分别计算三种树脂采用不同浓度乙醇溶液解吸的解吸率(%)。每组试验重复两次。

吸附率=(C1V1-C2V2)×100/C1V1

(2)

解吸率=C3V3×100/(C1V1-C2V2)

(3)

式中C1为吸附前提取液中原花色素含量(mg/mL)，C2为吸附后滤液中原花色素含量(mg/mL)，C3为解吸液中原花色素含量(mg/mL)，V1为苹果原花色素提取液加入量(mL)，V2为吸附后滤液体积(mL)，V3为解吸液体积(mL)。

1.2.5 苹果原花色素分离前后对超氧阴离子的清除作用

向按最佳提取工艺条件提取的苹果原花色素提取液和AB-8树脂吸附后经50%乙醇溶液解吸后所得的苹果原花色素解吸液中分别加入适量蒸馏水，使其原花色素浓度均为0.015 mg/mL。然后按文献[15]操作，测定经适度稀释后的苹果原花色素提取液和解吸液对超氧阴离子的清除率。每组试验重复两次。

2 结果与分析

2.1 苹果原花色素提取条件的优化

为了确定苹果原花色素最佳提取工艺，在单因素试验基础上设计了四因素三水平正交试验L9(34)，具体设计和结果见表1，极差分析见表2。由表1和表2可知，影响苹果原花色素提取率的因素主次排序为：乙醇浓度>提取温度>料液比>提取时间。根据k值判断，苹果原花色素的最佳提取工艺为A2B1C2D2，即乙醇浓度40%、料液比1∶7 g/mL、提取时间80 min、提取温度60 ℃，在此条件下进行试验，苹果原花色素提取率为0.051%，高于所有正交试验组合的提取率，故确定通过正交试验优化得到的条件为苹果原花色素的最佳提取工艺条件。

表1 正交试验设计及结果

表2 正交试验极差分析

2.2 三种大孔吸附树脂对苹果原花色素静态吸附与解吸效果比较

三种大孔吸附树脂对苹果原花色素静态吸附及不同浓度乙醇溶液静态解吸苹果原花色素的结果见表3。由表3可知，三种大孔吸附树脂中AB-8对苹果原花色素的吸附效果最强，HPD100对苹果原花色素的吸附效果最弱，但吸附率接近，这可能与原花色素及三种树脂的极性有关。原花色素是多酚类化合物，具有较弱的极性；而AB-8树脂呈弱极性，D101和HPD100为非极性树脂，三种树脂极性相近，所以AB-8树脂对苹果原花色素的吸附效果最强，但不突出。从解吸效果看，50%乙醇溶液对AB-8树脂吸附的苹果原花色素解吸效果最好，解吸率达65.57%。考虑到树脂不仅要具有较强的吸附能力，还需要易解吸，因此采用AB-8树脂对苹果原花色素提取液中的原花色素进行吸附，然后以50%乙醇溶液进行解吸，解吸液中的苹果原花色素含量可达0.027 mg/mL。

表3 三种大孔吸附树脂对苹果原花色素静态吸附与解吸结果

2.3 苹果原花色素分离前后对超氧阴离子的清除作用

苹果原花色素经AB-8树脂分离前后对超氧阴离子的清除效果见表4。由表4可以看出，两种溶液中的苹果原花色素的浓度一致，但0.015 mg/mL的解吸液对超氧阴离子的清除率可达35.21%，较0.015 mg/mL的提取液对超氧阴离子的清除率有大幅度提高。这说明苹果原花色素提取液经过AB-8树脂分离后，去除了部分杂质，减少了杂质对苹果原花色素抗氧化作用的影响，通过分离可以显著提高苹果原花色素的抗氧化作用。

表4 苹果原花色素分离前后对超氧阴离子的清除率

3 结论

以去皮苹果为原料，通过试验确定乙醇溶液提取苹果原花色素的最佳工艺条件为：乙醇浓度40%、料液比1∶7 g/mL、提取时间80 min、提取温度60 ℃，在此条件下进行试验，苹果原花色素提取率为0.051%。通过极差分析发现，影响苹果原花色素提取率的因素主次排序为：乙醇浓度>提取温度>料液比>提取时间。通过D101、AB-8、HPD100等三种大孔吸附树脂对苹果原花色素进行静态吸附及采用不同浓度乙醇溶液进行静态解吸的比较，发现AB-8树脂对苹果原花色素提取液中的原花色素吸附效果最好，吸附率达79.36%；然后以50%乙醇溶液进行解吸，解吸率可达65.57%，解吸液中的苹果原花色素含量可达0.027 mg/mL。此外，通过测定0.015 mg/mL的苹果原花色素解吸液和苹果原花色素提取液对超氧阴离子的清除率发现，0.015 mg/mL的苹果原花色素解吸液对超氧阴离子的清除率可达35.21%，清除效果较苹果原花色素提取液明显提高，说明通过分离可以加强苹果原花色素的抗氧化作用。