浅谈提高兽医比对实验准确性的方法

屈生跃 张书光

(1，云南省盈江县芒章畜牧兽医站 678300；2，云南省德宏州动物疫病预防控制中心 678400)

为了加强兽医系统实验室能力建设，农业农村部每年都组织省级兽医实验室进行检测能力比对工作。省级比对完成后由各省组织各地州（市）级实验室参加比对。通过比对，可直观的衡量出各实验室检测能力水平，发现实验室管理中存在的不足，对兽医系统实验室整体工作水平的提高起到积极推动作用。

对比实验具有可比较性和可重复性，实验结果容易观察和辨认，能客观反映出实验人员的水平和能力的优点[1]。另外，由于近年来动物防疫工作的需要，有的把实验结果直接与目标管理考核和绩效考评挂钩，有时一个实验结果的好坏决定排名先后，甚至是年度工作绩效和收入。因此，各地兽医实验室非常重视这一实验。

1 ELISA

ELISA 实验最难以理解和最重要的就是公式的设定，以小反刍兽疫抗体ELISA 检测试剂盒说明书为例。（1）计算公式：PI（抑制百分率）=100-（血清样品 OD 值/M 孔平均 OD 值）×100；（2）结果判定成立条件：结果 PI≥50 为阳性，PI＜50 为阴性。

由于酶标仪只能设定临界OD 值，所以要根据试剂盒说明书计算出样品OD 值＜多少为阳性或阴性，很多实验室人员不会计算。详细计算方法如下：将样品OD 值设为X，M 孔平均OD值我们设为机器可以判定的PC1，带入计算公式可以得出PI=100-（X/PC1）×100，根据 PI≥50 为阳性得出：100-（X/PC1）×100≥50 为阳性，解不等式解出 X≦0.5×PC1 为阳性，反之为阴性。因此样品 OD 值的临界值为 0.5×PC1，将 0.5×PC1 输入机器即可完成机器公式的设定，阴阳性对照成立条件计算方法是将阴阳性对照作为血清样品，同上计算出临界值即可。

2 血凝与血凝抑制实验

2.1 1%红细胞悬液的配制

洗红细胞要保证红细胞不能破裂，洗红细胞要洗3～5 次，直上清清亮为止，移取时尽量轻取轻放；当红细胞配制浓度偏低时，终点判定很容易出现错误，这也多是找不到实验失败原因的主要问题。

2.2 血凝实验

为准确测量出血凝结，一般要求做3 排相同的实验。加红细胞要注意防止" 挂滴” 现象的发生 (红细胞没有全部加到孔中，而是有一部分挂在吸嘴尖上)。HA 实验结果判断时要求将板倾斜45°，观察沉积红细胞流淌情况，凡是有流淌的都不能算成100%凝集。掌握100%红细胞凝集作为血凝实验的终点很重要，如果终点孔中心有点状沉积，都对以后的实验有较大的影响。红细胞没有充分打散或采血后血液与抗凝剂没有充分混匀常出现这种情况。

2.3 抗原回测

抗原回测是适时检测4 单位抗原配制是否准确的重要方法[2]。从左至右第一列为4 单位抗原，第二列为2 单位抗原，第三列为一单位抗原，第四列为1/2 单位抗原。如果前三孔凝集，第四孔不凝集，则4 单位抗原准确无误；若4 孔都凝集，表示抗原浓度偏高；若前两孔凝集，3、4 孔不凝集，则表示抗原浓度偏低。过高或者过低都建议重新配制，以免影响血凝抑制实验结果准确性。

3 PCR

3.1 所有使用耗材的灭菌

参加比对实验前，一定要对所有用到的实验耗材进行高压灭菌和干燥，防止交叉污染。

3.2 提取核酸

建议使用全自动核酸提取仪进行核酸提取，减少人为提取核酸造成的误差；两个人做平行实验，同时提取。

3.3 PCR 和电泳

PCR 配体系、加样和电泳都设置两人平行操作，结果完全相同则直接提交结果，结果不一致的以业务水平较高的为准。

4 讨论

3 个实验最容易出错的是血凝和血凝抑制实验，任何一个环节的失误都会前功尽弃，因此，参加比对实验时建议将血凝和血凝抑制实验分成两步：第一步血凝实验、4 单位抗原配制和抗原回测，若抗原回测完全正确再开始第二步，如果抗原回测一直不正确或者血凝实验结果异常，一定要重新买鸡从头开始；第二步再加盲样进行血凝抑制实验。血凝抑制实验每一步也建议设置平行对照，两人做出的结果分析评定后再行提交。