高效液相色谱-串联质谱法测定蜂蜜中9种农药残留

朱之烔, 柳 菡*, 宁倩倩, 张 健, 沈伟健,陈惠兰, 沈崇钰, 谢 文

(1. 南京海关动植物与食品检测中心, 江苏 南京 210019; 2. 杭州海关, 浙江 杭州 310016)

苯并咪唑类农药是一类低毒高效内吸性的广谱杀菌剂[1]。其中多菌灵(carbendazim)、甲基托布津(thiophanate-methyl)及乙基托布津(thiophanate-ethyl)较为常见,在水果蔬菜及农副产品中检出率较高[2,3]。其中多菌灵的急性毒性比较低,但它在自然界中降解半衰期长,可通过食物链蓄积对人类身体健康尤其是生殖系统造成危害[4]。而甲基托布津不稳定,会在植物体内中转化为多菌灵[5]。洛苯达唑(lobendazole,即ethylN-(1H-benzimidazol-2-yl)carbamate,简称EBC)是乙基托布津在生物体内的代谢物[5]。研究表明,其小鼠静脉注射半数致死量(lethal median dose, LD50)为180 mg/kg,具有一定的生殖毒性,能够影响胎儿的肌肉骨骼发育,具有一定的致畸性[6]。

新烟碱类农药是一类昆虫乙酰胆碱受体激动剂,能引发剧烈的神经毒害效应[1]。其中常见的有吡虫啉、啶虫脒、噻虫胺、噻虫嗪等。虽然对哺乳动物无毒害作用,但新烟碱类杀虫剂会对蜜蜂免疫系统和中枢神经系统等造成损伤,甚至引起蜜蜂急性中毒死亡[7],不仅仅使养蜂业承受了巨大的经济损失,更会危害整个生态系统。

蜂蜜是一种营养丰富的纯天然滋养食品。但由于蜜蜂在采蜜过程中采集了被农药污染的花粉及蜂农不恰当使用的农药,导致蜂蜜中的农药残留量有可能超标。研究表明,全球超过75%的蜂蜜含有至少一种农药的残留[8]。目前,欧盟规定蜂蜜中多菌灵和苯菌灵总和不超过1.0 mg/kg[9],并自2013年以来限用并将全面禁用3种新烟碱类杀虫剂(吡虫啉、噻虫胺和噻虫嗪)[10]。而我国暂未规定蜂蜜中这两类农药的残留限量。

目前国内分别检测苯并咪唑类和新烟碱类农药残留的文献有很多,包括了紫外可见分光光度法[11]、免疫化学法[12,13]、高效液相色谱法[14,15]、高效液相色谱-质谱联用法[16,17]和离子交换色谱法[18]等方法。其中,高效液相色谱-质谱联用法抗干扰能力强,灵敏度高,是主要的分析方法。但针对蜂蜜基质的研究不多,且同时涉及两类农药的较少,对洛苯达唑的研究报道极少。蜂蜜中含有大量的糖类物质和少量的有机杂质,蜂蜜中农药残留的前处理方法有液液萃取法[16]、分散固相萃取法[17]和固相萃取法[19]等。由于基质效应的存在,报道的研究大多使用基质校准曲线。本研究针对4种苯并咪唑类农药(多菌灵、甲基托布津、乙基托布津、洛苯达唑)和5种新烟碱类农药(吡虫啉、啶虫脒、呋虫胺、烯啶酰胺和氟啶虫酰胺),采用同位素内标法定量,在此基础上比较了不同的溶解试剂和前处理净化方式,建立了蜂蜜中9种苯并咪唑类和新烟碱类农药残留的全自动固相萃取-高效液相色谱-串联质谱测定方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260 Infinity II高效液相色谱仪和Agilent 6470A三重四极杆质谱仪(美国Agilent公司);真空氮气吹干仪(美国Caliper公司); Heraeus Mutifuge X1R离心机(美国Thermo-Fisher公司); Smart-N超纯水机(美国Millipore公司);亲水亲脂平衡(hydrophilic-lipophilic balance, HLB)固相萃取柱(美国WATERS公司); Preval SPE 304+全自动固相萃取装置(北京普立泰科仪器公司)。

多菌灵、甲基托布津、乙基托布津、吡虫啉、啶虫脒、呋虫胺、烯啶虫胺和氟啶虫酰胺,纯度均高于97%(德国Dr. Ehrenstorfer公司);洛苯达唑,纯度高于99%(北京曼哈格生物科技有限公司);多菌灵-D4、吡虫啉-D4,纯度均高于97%(美国Sigma-Aldrich公司);甲醇、甲酸、乙腈、乙酸乙酯,均为色谱纯(德国Merck公司);水合磷酸二氢钾,分析纯(南京化学试剂有限公司);N-丙基乙二胺(PSA), 40～60 μm(美国Sepax Technologies公司);实验用蜂蜜样品均购自超市。

1.2 标准溶液的配制

标准储备液:准确称取9种农药标准品各5.0 mg,分别用甲醇溶解并定容至50 mL,配制成质量浓度为100 mg/L的标准储备液(多菌灵和洛苯达唑可以加入适量甲酸助溶),放置在-18 ℃的冰箱中冷冻保存。

混合标准工作溶液:分别取适量上述9种农药的标准储备液,用甲醇逐级稀释,配制成1 mg/L和0.1 mg/L的混合标准工作液,放置在-4 ℃的冰箱中保存。

内标储备液:准确称取10.0 mg的多菌灵-D4、吡虫啉-D4,用甲醇溶解并定容至100 mL,配制成100 mg/L的内标储备液,放置在-18 ℃的冰箱中冷冻保存。

内标工作溶液:取适量内标储备液,用甲醇稀释,配制成0.1 mg/L内标工作溶液,放置在-4 ℃的冰箱中保存。

标准曲线的配制:准确吸取内标工作液100 μL、标准工作液适量,以甲醇-水溶液(3∶7, v/v)配制质量浓度为0.002、0.005、0.01、0.02、0.05 mg/L的溶液,现配现用。

磷酸盐缓冲液的配制:准确称量27.2 g水合磷酸二氢钾固体,先用800 mL水溶解,再用6 mol/L NaOH溶液调节pH至7.8,加水至1 000 mL。

1.3 样品前处理

1.3.1提取

准确称量提前混匀的蜂蜜样品(1.00±0.05) g,置于50 mL塑料离心管中,加入100 μL内标溶液、15 mL磷酸盐缓冲溶液,加盖涡旋使溶液充分溶解、混匀;超声15 min;用滤纸过滤至20 mL玻璃试管中,待净化。

1.3.2净化

先将上述玻璃试管放入全自动固相萃取仪中,再将HLB固相萃取柱放入全自动固相萃取仪中,预先设计好程序(HLB固相萃取柱用5 mL甲醇活化,5 mL水平衡,采用3 mL/min的流速上样,5 mL水淋洗,5 mL甲醇洗脱),样品按此程序进行净化;洗脱液在45 ℃水浴下氮气吹干;用甲醇-水溶液(3∶7, v/v)定容至1.0 mL,涡旋30 s,过0.22 μm滤膜至进样小瓶中,供液相色谱-质谱联用仪测定。

1.4 分析条件

1.4.1色谱条件

色谱柱:SVEA C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 5 μm);柱温:40 ℃;流动相A相为0.1%(v/v)甲酸水溶液,B相为0.1%(v/v)甲酸甲醇溶液;流速:0.4 mL/min。梯度洗脱程序:0～1 min, 95%A; 1～2 min, 95%A～40%A; 2～5 min, 40%A～0%A; 5～6 min, 0%A～95%A。进样量:10 μL。

1.4.2质谱条件

离子源:电喷雾离子(ESI)源,正离子模式;多反应监测(MRM)模式;喷雾电压:4 000 V;干燥气温度:350 ℃;干燥气流速:10 L/min;雾化气压力:344 kPa;鞘气温度:400 ℃;鞘气流速:12 L/min; 11种化合物的其他质谱参数见表1。

表 1 11种化合物的监测离子对、毛细管出口电压、碰撞能量、保留时间及内标物Table 1 Monitoring ion pairs, fragmentor, collision energy, retention time and internal standards of the 11 compounds

表 1 (续)Table 1 (Continued)

* Quantitative ion.

2 结果与讨论

2.1 前处理方法的优化

蜂蜜中含有大量的糖类物质和少量的有机杂质,本实验着重于前处理方法的研究。在50.0 μg/kg水平下,各前处理方法分别做3个平行的阴性样品加标试验,以平均回收率判定方法的优劣。

图 1 不同溶剂对乙酸乙酯提取后的目标化合物回收率的影响Fig. 1 Effect of the different dissolving reagents on the recoveries of the target compounds after extraction with ethyl acetate

2.1.1样品溶解试剂的确定

由于蜂蜜基质的特殊性,直接加入有机试剂时样品易变成胶质状,故先用少量水溶解、稀释蜂蜜,使其成为均相体系。研究最初采用液液萃取法进行预处理,而乙酸乙酯是常用的提取试剂,且据报道[16]对多菌灵等农药有较高的回收率。故在样品内加入乙酸乙酯,涡旋、超声、离心后,将提取液氮吹浓缩至干,复溶后进行液相色谱-质谱联用分析。实验结果如图1所示,仅有多菌灵、洛苯达唑、吡虫啉和啶虫脒的回收率达到80%,呋虫胺约40%,而甲基托布津、乙基托布津、烯啶虫胺和氟啶虫酰胺的回收率不足25%。

蜂蜜溶于水后的溶液偏酸性,而且研究中的农药呈中性至弱碱性,可能会以离子形式存在于蜂蜜水溶液中,不利于有机溶剂提取。因此,考虑使用偏碱性的磷酸盐缓冲液(pH=7.8)来溶解和稀释蜂蜜,使目标物在此pH值下以分子形式存在,再加入乙酸乙酯超声提取,提取液浓缩定容后,进行液相色谱-质谱联用分析,结果如图1所示。在缓冲液溶解样品后,呋虫胺的回收率提高明显,达到了70%以上。甲基托布津、乙基托布津、烯啶虫酰胺和氟啶虫酰胺也均有一定提高,但仍不足50%。多菌灵、洛苯达唑、吡虫啉和啶虫脒也均有较好的回收率。故选用磷酸盐缓冲液作为蜂蜜样品的溶解试剂。

2.1.2样品前处理方法的选择

研究比较了乙酸乙酯萃取法、QuEChERS法和固相萃取法的净化效果。QuEChERS法是以乙腈作提取溶剂,加入适量的盐,以盐析作用促进提取,分散固相萃取法净化来完成[20]。将样品用少量缓冲液溶解后,加入适量乙腈超声提取。考虑到PSA可以吸附基质中各种极性有机酸、糖类和脂肪等杂质,故在盐析过程中加入少量PSA除杂。

固相萃取技术能够选择性吸附、保留目标物,除去杂质的同时,还能起到浓缩的作用。其中的HLB固相萃取柱常用于净化蜂蜜中大量糖类及极性极强的杂质[19]。蜂蜜样品经缓冲液溶解后,需过滤以避免固相萃取柱堵塞。过滤液经固相萃取柱净化后,收集的洗脱液经氮吹复溶后进行液相色谱-质谱联用分析。

由图2可知,对于多菌灵、洛苯达唑和吡虫啉,3种方法均有较好的回收率;对于啶虫脒、呋虫胺,乙酸乙酯萃取法和固相萃取法的回收率可达75%以上;对于烯啶虫胺、氟啶虫酰胺,QuEChERS法和固相萃取法的回收率达到75%以上;对于甲基托布津和乙基托布津,仅有固相萃取法的回收率较好。故选择HLB固相萃取法对样品进行净化。

图 2 不同前处理方法对目标化合物回收率的影响Fig. 2 Effect of different pretreatment methods on the recoveries of the target compounds Method 1: extraction by ethyl acetate; method 2: extraction by QuEChERS; method 3: extraction by solid-phase extraction with hydrophilic-lipophilic balance (HLB) cartridges.

2.2 仪器条件优化

2.2.1色谱条件的优化

实验之初以水溶液作为水相,发现甲基托布津和乙基托布津的峰形拖尾严重,其他化合物的峰形也存在一定程度的不对称。而以0.1%(v/v)甲酸作水相时,各化合物的峰形对称,如图3所示。因此采用0.1%(v/v)甲酸溶液作水相,0.1%(v/v)甲酸甲醇为有机相。

2.2.2质谱条件的确定

研究的9种农药以及同位素内标的分子结构均含有氨基,易形成正离子,故采用正离子模式进行电离。在MRM模式下对11种化合物的母离子、毛细管出口电压,子离子、碰撞能量等条件进行优化,结果如表1所示。由于流动相中添加少量甲酸,11种化合物的母离子峰均为加氢峰。

图 3 0.05 mg/L标准溶液中11种化合物的MRM色谱图Fig. 3 MRM chromatograms of the 11 compounds in 0.05 mg/L standard solution

2.3 方法学验证

2.3.1线性范围、检出限和定量限

确定实验方法后,按照1.2节配制标准曲线,进行标准溶液的测定。以质量浓度(X, mg/L)为横坐标,标准物的峰面积与内标物的峰面积之比(Y)为纵坐标,绘制标准曲线。结果显示,在0.002～0.05 mg/L范围内,9种农药均呈现出良好的线性关系(相关系数r2≥0.99),如表2所示。在阴性蜂蜜中加标测定,3倍信噪比对应的加标水平为方法的检出限,10倍为定量限,结果如表2所示。

2.3.2回收率和精密度

选取阴性蜂蜜样品,分别在5.0、10.0、20.0 μg/kg 3个水平下进行加标试验,测得的回收率和精密度如表3所示。结果显示,蜂蜜中9种农药的平均回收率在78.2%～104.6%之间,相对标准偏差在1.3%～14.3%之间。

表 2 9种农药的回归方程、相关系数、检出限和定量限Table 2 Regression equations, correlation coefficients (r2), LODs and LOQs of the nine pesticides

Y: peak area ratio of the quantitative ion of pesticide to internal standard;X: mass concentration, mg/L.

表 3 阴性蜂蜜中9种农药的加标回收率和相对标准偏差(n=6)Table 3 Recoveries and RSDs of the nine pesticides in blank honey (n=6)

2.4 实际样品检测

用上述建立的方法对实际蜂蜜样品进行检测。选择30批蜂蜜样品进行检测,多菌灵、吡虫啉和啶虫脒分别有不同程度的检出。其中多菌灵检出17批,残留量在5～10 μg/kg之间。吡虫啉和啶虫脒分别检出13批和12批,检出量分别为5～20 μg/kg和5～10 μg/kg。其余农药未检出。

3 结论

本研究建立了蜂蜜样品经缓冲液溶解、稀释、提取,通过HLB固相萃取柱净化,液相色谱-质谱联用仪分析的检测方法。此方法前处理简单、快速,操作简便易行,且准确,灵敏度高,重现性好,检出限低,能够满足大批量蜂蜜样品中9种苯并咪唑类、新烟碱类农药同时检测的要求。