银叶凤尾蕨化学成分的研究

邹 娟，赵臣亮，何 康，谭宏燕，张敬杰，潘炉台

（贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025）

银叶凤尾蕨Pteris creticavar.silvestris为欧洲凤尾蕨的变种，目前仅发现于贵州紫云县，是凤尾蕨科凤尾蕨属多年生常绿草本植物［1］。欧洲凤尾蕨全草入药，具有清热利湿、活血止痛的功效，贵州民间用于治疗跌打损伤、腹痛、黄疸、痢疾、淋证、水肿、烧烫伤以及犬蛇咬伤等［2］，银叶凤尾蕨在民间常作欧洲凤尾蕨的替用药，其化学成分未见报道。国外学者先后对日本、意大利等地的欧洲凤尾蕨化学成分做了相关研究［3-7］，发现其主要含二萜、三萜和黄酮类；王慧娟［8］等对欧洲凤尾蕨提取物的药理进行研究，发现其具有较好的抗菌活性。为对凤尾蕨属植物综合开发利用，探究其生理活性成分，本课题组对贵州紫云产银叶凤尾蕨进行化学成分研究。从中分离得到12 个化合物，均为首次从该植物中分离得到。研究表明，化合物1、4 具有一定的肿瘤细胞毒活性［9］，化合物3 对NCIH1650、HepG2、BGC-823、HCT-116、A2780 等多种肿瘤细胞具有较好的抑制活性［10］；化合物6 具有抗炎及抗肿瘤活性［11-12］。

1 材料

Q-TOF 质谱仪（德国Bruker 公司）；Inova-400 MHz 核磁共振仪（美国Varian 公司）；Agilent 1100分析、半制备型高效液相色谱仪（美国Agilent 公司）；R215 旋转蒸发仪（瑞士Buchi 实验室仪器公司）；FZ102 微型植物粉碎机（上海书培实验设备有限公司）；电子天平（瑞士Metter-Toledo 公司）；Sephadex LH-20（美国通用电气医疗集团）；P-1 型薄层层析色谱展开缸（双槽立式，上海江仪仪器有限公司）；GF254制备薄层板及200～300 目柱色谱用硅胶（青岛海洋化工有限公司）。所用试剂均为分析纯。药材于2014 年7 月采自贵州省紫云县，经贵州中医药大学赵俊华教授鉴定为凤尾蕨科凤尾蕨属植物银叶凤尾蕨Pteris creticavar.silvestris，植物标本存放于贵州中医药大学。

2 提取与分离

自然干燥的银叶凤尾蕨叶29.3 kg 粉碎成粗粉（60～80 目），90% 甲醇冷浸法提取4 次（每次5 d），过滤提取液，减压回收甲醇后得浸膏2.6 kg。加水溶解后，依次用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯萃取，减压浓缩3 个部分萃取液，分别得浸膏0.5、1.3、0.8 kg。

石油醚部分进行硅胶柱层析，石油醚-二氯甲烷（100∶1～0∶100）梯度洗脱，TLC 检测后，将极性相近部分进行分段，得到2 个组分Fr.A-Ⅰ（278 g）、Fr.A-Ⅱ（127 g）。Fr.A-Ⅱ组分经石油醚-二氯甲烷（10∶1～0∶10）系统梯度洗脱，抽滤后用Sephadex LH-20 进行纯化，得化合物8（13 mg）。

二氯甲烷部分进行硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯（100∶1～0∶100）梯度洗脱，得4 个组分Fr.B-Ⅰ（168 g）、Fr.B-Ⅱ（175 g）、Fr.B-Ⅲ（288 g）、Fr.B-Ⅳ（235 g）。Fr.B-Ⅱ组分进行硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，得5 个组分Fr.B-Ⅱ-1（23 g）、Fr.B-Ⅱ-2（18 g）、Fr.B-Ⅱ-3（22 g）、Fr.B-Ⅱ-4（25 g）、Fr.B-Ⅱ-5（15 g）。Fr.B-Ⅱ-2、Fr.B-Ⅱ-4 分别用硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱（95∶5～0∶100），甲醇重结晶后得化合物1（3.2 g）、9（2.6 g）；Fr.B-Ⅱ-3 经硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱，经Sephadex LH-20 纯化，得化合物5（20 mg）、6（17 mg）。Fr.B-Ⅲ组分进行硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱（100∶1～0∶100），得3 个组分Fr.B-Ⅲ-1（33 g）、Fr.B-Ⅲ-2（89 g）、Fr.B-Ⅲ-3（62 g）。其中，Fr.B-Ⅲ-1 组分经硅胶柱层析，石油醚-丙酮梯度洗脱（10∶1～0∶10），Sephadex LH-20 纯化后得化合物2（88 mg）、3（48 mg）、12（19 mg）。

乙酸乙酯部分进行硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯（100∶1～0∶100）梯度洗脱，得4 个组分Fr.C-Ⅰ（68 g）、Fr.C-Ⅱ（105 g）、Fr.C-Ⅲ（188 g）、Fr.C-Ⅳ（135 g）。Fr.C-Ⅱ组分用硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱（100∶1～0∶100）后，结合凝胶及半制备HPLC 色谱仪得化合物7（14 mg）；Fr.C-Ⅲ组分经硅胶柱层析，二氯甲烷-乙酸乙酯梯度洗脱（100∶1～0∶100）后，甲醇重结晶得化合物4（34 mg）；Fr.C-Ⅳ组分用硅胶柱层析，石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱（100∶1～0∶100）后，经半制备HPLC 色谱仪多次分离，得化合物10（15 mg）、11（19 mg）。

3 结构鉴定

化合物1：乳白色粉末（甲醇）。10%硫酸-乙醇溶液加热显粉紫色。EI-MSm／z：306［M］+，结合碳谱数据，推测其分子式C20H34O2，不饱和度4。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：3.94（1H，m，H-2），1.35（3H，s，H-17），1.19（1H，m，H-9），1.04（3H，s，CH3-20），0.91（3H，s，CH3-18），0.83（3H，s，CH3-19），0.78（1H，m，H-5）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：49.6（C-1），65.3（C.-2），51.3（C-3），35.0（C-4），56.7（C-5），26.9（C-6），41.9（C-7），45.3（C-8），55.7（C-9），41.1（C-10），18.2（C-11），20.2（C-12），49.1（C-13），37.8（C-14），57.9（C-15），79.3（C-16），24.6（C-17），33.7（C-18），22.5（C-19），18.9（C-20）。以上数据与文献［13］基本一致，故鉴定为2β，16α-diol-ent-kaurane。

化合物2：无色晶体（吡 啶），mp 216～218 ℃。10% 硫酸-乙醇溶液加热显紫色。1H-NMR（400 MHz，C5D5N）δ：5.22（1H，s，H-17a），5.17（1H，s，H-17b），4.02（1H，m，H-2），3.99（1H，dd，J=9.8，3.0 Hz，H-6），3.92（1H，s，H-15），2.64（1H，m，H-13），2.05（1H，d，J=11.2 Hz，H-7），1.91（2H，d，J=14.6 Hz，H-12），1.23（3H，s，CH3-18），1.05（3H，s，CH3-19），0.99（3H，s，CH3-20）；13CNMR（100 MHz，C5D5N）δ：51.6（C-1），64.3（C-2），54.8（C-3），36.5（C-4），61.2（C-5），68.5（C-6），46.1（C-7），48.5（C-8），55.0（C-9），43.2（C-10），18.9（C-11），33.6（C-12），42.4（C-13），37.5（C-14），83.4（C-15），161.8（C-16），109.0（C-17），37.8（C-18），24.0（C-19），20.5（C-20）。以上数据与文献［14-17］基本一 致，故 鉴 定 为2β，6β，15α-trihydroxy-entkaur-16-ene。

化合物3：白色粉末（甲醇）。10%硫酸-乙醇溶液加热不显色，碘显色呈黄棕色。EI-MSm／z：305 ［M+H］+，结合碳谱数据，推测其分子式C20H32O2，不饱和度 5。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：5.11（1H，s，H-15），3.83（1H，m，H-6），2.32（1H，dd，J=11.7，3.6 Hz，H-1a），2.11（1H，dd，J=12.1，4.0 Hz，H-14），2.04（1H，d，J=10.1 Hz，H-7），1.72（1H，m，H-9），1.68（1H，d，J=1.2 Hz，H-17），1.60（3H，brs，CH3-18），1.52（2H，m，H-11），1.47（2H，m，H-12），1.44（1H，m，H-13），1.21（3H，s，CH3-19），1.12（3H，s，CH3-20），1.11（1H，s，H-9），1.08（1H，d，J=10.5 Hz，H-5），0.94（1H，t，J=11.7 Hz，H-1b）；13CNMR（100 MHz，CD3OD）δ：50.3（C-1），65.1（C-2），54.1（C-3），36.6（C-4），61.4（C-5），68.1（C-6），45.6（C-7），50.1（C-8），49.5（C-9），43.9（C-10），19.9（C-11），26.1（C-12），45.6（C-13），50.9（C-14），136.3（C-15），143.9（C-16），15.4（C-17），37.5（C-18），23.1（C-19），20.1（C-20）。以上数据与文献［10］基本一致，故鉴定为multikaurane A。

化合物4：白色粉末（甲醇）。10%硫酸-乙醇溶液加热显紫红色。EI-MSm／z：304［M］+，结合碳谱数据，推测其分子式C20H32O2，不饱和度5。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：4.96～5.38（1H，dd，J=15.0 Hz，H-17），3.92（1H，m，H-2），2.75（1H，m，H-12），1.95（1H，m，H-14），1.12（1H，m，H-9），0.99（3H，s，CH3-18），0.93（3H，s，CH3-19）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：50.4（C-1），65.5（C-2），51.8（C-3），42.4（C-4），57.0（C-5），20.3（C-6），19.3（C-7），48.9（C-8），55.9（C-9），35.6（C-10），36.5（C-11），43.7（C-12），33.9（C-13），37.4（C-14），83.8（C-15），160.4（C-16），109.1（C-17），34.3（C-18），22.9（C-19），19.4（C-20）。以上数据与文献［13］基本一致，故鉴定为2β，15α-diol-ent-kaur-16-ene。

化合物5：白色针晶（氯仿）。10%硫酸-乙醇溶液加热显紫红色。EI-MSm／z：442［M］+，结合碳谱数据，推测其分子式C30H50O2，不饱和度6。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：0.33（1H，d，J=4.0 Hz，H-19a），0.55（1H，d，J=4.0 Hz，H-19b），0.81（3H，s，H-30），0.89（6H，d，J=7.0 Hz，CH3-21，28），0.97（6H，s，CH3-18，29），1.73（3H，s，CH3-27），3.28（1H，m，H-3），4.02（1H，t，J=6.5 Hz，H-24），4.84（2H，s，H-26）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：30.4（C-1），29.9（C-2），78.8（C-3），40.5（C-4），47.1（C-5），21.1（C-6），28.1（C-7），48.0（C-8），20.0（C-9），26.0（C-10），26.0（C-11），35.9（C-12），45.2（C-13），48.8（C-14），32.8（C-15），26.4（C-16），52.1（C-17），18.0（C-18），28.1（C-19），35.5 和35.9（C-20），18.3（C-21），31.9 和31.9（C-22），31.6 和31.4（C-23），76.4（C-24），147.4 和 147.7（C-25），110.9 和111.4（C-26），17.2 和17.6（C-27），19.3（C-28），25.4（C-29），14.0（C-30）。以上数据与文献［18］基本一致，故鉴定为cycloart-25-en-3β，24-diol。

化合物6：淡黄色固体（甲醇），Libermann-Burchard 反应呈阳性，10% 硫酸-乙醇溶液加热显紫红色。EI-MSm／z：429 ［M+H］+，结合碳谱数据，推测其分子式C28H44O3，不饱和度7。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：6.51（2H，d，J=8.7 Hz，H-7），6.25（2H，d，J=8.7 Hz，H-6），5.16（1H，m，H-22），5.22（3H，m，H-23），3.97（1H，m，H-3），1.09（3H，s，CH3-21），0.92（3H，d，J=7.6 Hz，H-28），0.89（3H，s，CH3-19），0.82（3H，s，CH3-18），0.81（3H，d，J=7.6 Hz，H-26）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：34.8（C-1），30.2（C-2），66.6（C-3），37.0（C-4），82.3（C-5），135.5（C-6），130.9（C-7），79.6（C-8），51.1（C-9），37.0（C-10），23.5（C-11），39.4（C-12），44.7（C-13），51.8（C-14），20.8（C-15），28.8（C-16），56.2（C-17），13.0（C-18），18.3（C-19），39.9（C-20），21.0（C-21），135.3（C-22），132.4（C-23），42.9（C-24），33.2（C-25），19.8（C-26），20.1（C-27），17.7（C-28）。以上数据与文献［19］基本一致。故鉴定为（22E）-5α，8α-epidioxyergosta-6，22-dien-3β-ol。

化合物7：白色针晶（氯仿），Libermann-Burchard 反应呈阳性，10%硫酸-乙醇溶液加热显紫红色。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：5.37（1H，brd，J=4.9 Hz，H-6），3.53（1H，m，H-3），1.08（3H，s，CH3-19），0.96（3H，d，J=8.0 Hz，CH3-21），0.91（3H，s，J=8.0 Hz，CH3-29），0.86（3H，d，J=7.2 Hz，CH3-26），0.85（3H，d，J=7.2 Hz，CH3-27），0.67（3H，s，CH3-18）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：37.6（C-1），30.0（C-2），72.5（C-3），39.0（C-4），141.2（C-5），122.0（C-6），32.1（C-7），32.1（C-8），50.3（C-9），36.9（C-10），21.3（C-11），39.7（C-12），42.6（C-13），56.9（C-14），24.6（C-15），28.5（C-16），56.1（C-17），12.4（C-18），19.7（C-19），36.2（C-20），19.3（C-21），34.1（C-22），26.1（C-23），45.9（C-24），29.4（C-25），19.8（C-26），20.4（C-27），23.3（C-28），12.5（C-29）。以上数据与文献［20］基本一致，故鉴定为β-谷甾醇。

化合物8：白色油状液体（氯仿）。10%硫酸-乙醇溶液加热不显色，用碘显色为黄棕色。EI-MSm／z：185 ［M-H］-，结合碳谱数据，推测其分子式C12H26O，不 饱 和 度0。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：3.65（2H，t，J=6.6 Hz，H-1），1.58（2H，m，H-2），1.26（18H，s，H-3～H-11），0.88（3H，t，J=6.9 Hz，H-12）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：63.3（C-1），32.9（C-2），32.1（C-3），29.9（C-4），29.8（C-5），29.8（C-6），29.8（C-7），29.6（C-8），29.5（C-9），25.9（C-10），22.9（C-11），14.3（C-12）。以上数据与文献［21］基本一致，故鉴定为正十二烷醇。

化合物9：白色结晶性蜡状固体（氯仿），mp 54～55 ℃。10% 硫酸-乙醇溶液加热不显色，用碘显色为黄棕色。EI-MSm／z：228［M］+，结合碳谱数据，推测其分子式C14H28O2，不饱和度1。1HNMR（400 MHz，CDCl3）δ：2.32（2H，t，H-2），1.26（32H，m，H-3～H-13），0.88（3H，t，H-14）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：173.5（C-1），34.2（C-2），32.1（C-3），29.8（C-4），29.8（C-5），29.8（C-6），29.7（C-7），29.6（C-8），29.5（C-9），29.4（C-10），29.3（C-11），25.0（C-12），22.9（C-13），14.3（C-14）。以上数据与文献［22］基本一致，故鉴定为正十四烷酸。

化合物10：白色粉末状固体（氯仿），mp 63～64 ℃。10%硫酸-乙醇溶液加热不显色，用碘显色为黄棕色。EI-MSm／z：257 ［M+H］+，结合碳谱数据，推测其分子式C16H32O2，不饱和度1。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：0.89（3H，t，J=6.7 Hz，CH3-16），1.64（26H，m，H-3～H-15），2.36（2H，t，J=7.5 Hz，H-2）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：179.9（C-1），34.1（C-2），32.0（C-3），29.8（C-4），29.8（C-5），29.8（C-6），29.8（C-7），29.8（C-8），29.7（C-9），29.5（C-10），29.5（C-11），29.4（C-12），29.2（C-13），24.8（C-14），22.8（C-15），14.1（C-16）。以上数据与文献［23］基本一致，故鉴定为正十六烷酸。

化合物11：白色粉末（氯仿）。10% 硫酸-乙醇溶液加热显红色。EI-MSm／z：297 ［M-H］-，结合碳谱数据，推测其分子式C19H38O2，不饱和度1。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：4.14（2H，m，H-18），2.33（2H，m，H-2），0.87（6H，t，J=6.9 Hz，CH3-17，CH3-19）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：174.1（C-1），34.2（C-2），25.0（C-3），29.2（C-4），29.8（C-5），29.8（C-6），29.8（C-7），29.8（C-8），29.8（C-9），29.6（C-10），29.5（C-11），29.5（C-12），29.4（C-13），29.3（C-14），32.1（C-15），22.8（C-16），14.3（C-17），65.2（C-18），14.3（C-19）。以上数据与文献［24］基本一致，故鉴定为十七烷酸乙酯。

化合物12：白色片状晶体，mp 68～71 ℃。10%硫酸-乙醇溶液加热不显色，用碘显色为黄棕色。EI-MSm／z：284［M］+，结合碳谱数据，推测其分子式C18H36O2，不饱和度1。1H-NMR（400 MHz，C5d5N）δ：0.87（3H，t，J=5.64 Hz，CH3-18），1.30（28H，m，H-4～H-17），1.82（2H，m，H-3），2.53（2H，t，J=5.92 Hz，H-2）；13CNMR（100 MHz，C5d5N）δ：176.1（C-1），34.9（C-2），25.7（C-3），29.7、29.8、29.9、30.0、30.0 分别为C-4～C-15，32.2（C-16），23.0（C-17），14.3（C-18）。以上数据与文献［25］基本一致，故鉴定为硬脂酸。