QNMR法测定片剂中维生素B6的含量

鲁瑞娟 许秋梅

(绍兴文理学院 分析测试中心，浙江 绍兴 312000)

维生素B6又称吡哆素，是一种无色晶体，在酸液中稳定，易溶于水和酒精.在人体内，维生素B6以辅酶形式参与多种代谢，临床上常用于减轻妊娠呕吐[1].市售维生素B6片剂含有硬脂酸镁、淀粉、糊精等辅料，因此，测定维生素B6含量时还需考虑辅料的干扰.

目前，常见维生素B6含量的测定方法为紫外分光光度法和高效液相色谱法，这两种方法的测定结果均准确、可靠，但对待测样品纯度要求高、样品预处理过程复杂且需提供对照品[2-3].定量核磁共振(Quantitative Nuclear Magnetic Resonance,QNMR)法用于定量分析的基础是各化学环境中的质子吸收峰的面积只与所包含的质子数有关，不需引进任何校正因子就可直接根据各共振峰的积分值推算所代表的自旋核的数量[4]，相较于前两种常规方法具有样品预处理步骤简单、无需待测物对照品、测定快速准确、不破坏样品等优势，已收载于《中华人民共和国药典》[5].

目前有越来越多采用QNMR法测定维生素片剂研究的报道.例如，陈春丽等研究了片剂中维生素C含量的测定[6];胡敏芳等讨论了单组分以及复合组分维生素B2、B1含量的测定[7-9]，其所建立的QNMR测试方法准确度高、结果可靠；但是维生素B6含量测定的相关研究较少.本文在他人工作的基础上，采用1H-NMR方法测定片剂中维生素B6的含量，以期建立维生素B6的QNMR分析法.

1 实验部分

1.1 仪器

核磁共振波谱仪(瑞士Bruker，AVANCEⅢ 400 MHz)；超声波振荡仪(上海科导超声仪器有限公司，SK3210HP)；百万分之一天平(德国Sartorius公司，CPA2P)；电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司，AL 204).

1.2 试样和试剂

维生素B6片剂，由药店购买，标示量每片含维生素B610 mg(华中药业股份有限公司，批号：20170114)；顺丁烯二酸(阿拉丁试剂有限公司，经重结晶处理)；重水(百灵威试剂有限公司)；维生素B6标准品(阿拉丁试剂有限公司，分析标准品).

1.3 维生素B6片剂溶液配制

取维生素B6片剂30粒，用研钵研成粉末.精确称取22 mg维生素B6粉末，以及6 mg顺丁烯二酸，依次加入同一塑料离心管中；再加入D2O 0.6 mL，超声振动10 min，使其充分溶解，静置15 min；等到不溶的辅料沉淀完全后，取上清液进行核磁共振定量测定.

1.4 核磁共振谱仪的调节

将装有供试品溶液的核磁管放入核磁共振波谱仪中，调整仪器参数.先进行样品和谱仪的调谐，仔细匀场后采样，获得1H-NMR谱；再进行细致认真的相位校正，对样本和内标物的定量峰进行积分.每次测定取数至少重复5次，结果取平均值.

2 方法与结果

2.1 核磁测试条件的选择

定量峰的积分面积同多项核磁共振实验参数有关.张友杰等[10]研究了峰面积与延迟时间、脉冲宽度、采样次数、取数时间和发射偏置等因素的关系，发现对于不同的检测样品，影响较大的两个参数为采样次数和延迟时间.测试条件具体如下：脉冲序列为zg 30，采样温度T为298 K，谱宽SW为20.55×10-6，90°脉冲为13.5 s.

2.1.1 定标峰的选择

维生素B6片剂样品和标准品的1H-NMR谱图如图1所示.由于使用D2O作为溶剂，两个 — OCH2— 峰(δ=4.84、δ=4.64)与位于δ=4.70的溶剂峰距离太近，不能选用.吡啶环上的 — CH3峰化学位移δ=2.48，虽处于高场中，但离内标峰(δ=6.26)太远也不宜选用.因此，只有选择吡啶环上唯一的杂芳氢峰δ=8.00为定标峰时，得到的分析结果尚属满意.

2.1.2 弛豫时间的选择

设置核磁共振实验参数为：采样温度298 K,采样次数8次，测定不同弛豫时间下样品与内标物的积分面积，结果见表1.

由表1可见，随着弛豫时间的增加，当定标峰δ=8.00的积分面积恒定取为1时，其他几个峰的峰面积逐渐减少；当弛豫时间≥20 s时，质子数与积分值趋于一致，且内标峰的相对峰面积值趋于稳定.为了节省实验时间及提高分析的效率，本实验选取弛豫时间为20 s.

(a)样品 (b)标准品 图1 维生素B6样品和标准品的1H-NMR谱

2.1.3 采样次数的选择

设置核磁共振实验参数如下：采样温度298 K，弛豫时间20 s，测定不同采样次数下样品与内标物的积分面积.将定标峰δ=8.00的相对积分面积设为1，结果见表2.

由表2数据可见，当采样次数较少时，数据重现性比较差；当采样次数≥16后，内标峰面积变化趋于稳定，峰面积也趋近于实际质子数.因此，为了节省实验的时间，提高检测的效率，本实验选取采样次数为16次.

2.2 维生素B6含量的测定

由1H-NMR谱图读取样品定量峰和内标定量峰积分面积，并使用下面的公式计算样品的含量：

式中，WS表示内标物的质量，WX表示样品的质量；ES表示内标物的当量，顺丁烯二酸的当量为58.04；EX表示样品的当量，样品的当量=相对分子质量/定量峰对应的质子数，本实验中的该值为205.64；AS表示内标物定量峰峰面积，AX表示样品的定量峰峰面积.

由表3可见,8份样品中维生素B6的平均含量为15.29%，相对标准偏差为0.024.称取30片维生素B6的质量为1 830.00 mg，可知平均每片为61.00 mg，根据平均百分含量得到平均每片含量为9.327 mg，测定值在药典规定的标示范围(90.0%～110.0%)内.

2.3 回收率测试

在编号为1、2、3、4、5号的核磁样品管中分别加入维生素B6标准品约3.2 mg，超声振荡10 min，使其充分溶解后测定核磁共振氢谱，计算样品回收率，结果见表4.

表1 弛豫时间对维生素B6各峰相对面积的影响

弛豫时间/s各峰相对积分面积δ 8.00δ 6.26δ 4.84δ 2.4811.0006.7592.2573.21421.0006.6802.2333.16051.0006.6662.1753.098101.0006.6262.1523.062201.0006.6142.0873.041501.0006.6192.1013.033

表2 采样次数对维生素B6各峰相对面积的影响

采样次数各峰相对积分面积δ 8.00δ 6.26δ 4.84δ 2.4811.0006.6412.1073.03521.0006.6002.1423.04441.0006.6172.0953.05581.0006.6142.0873.041161.0006.5952.0953.037321.0006.5982.1053.025

表3 维生素B6含量的测定

样品编号样品量/mg内标量/mg样品峰面积Ax内标峰面积As含量/%平均值/%相对标准偏差122.6206.5001.0006.53115.59222.3456.4341.0006.78215.04322.4106.3421.0006.63315.12422.2736.3461.0006.85214.73521.6376.7251.0006.91715.92622.7936.9771.0007.08315.31724.5467.0271.0006.56015.46822.3606.2871.0006.59515.1115.290.024

表4 维生素B6的回收率测试

样品编号加入B6标准品量/mg样品峰面积Ax内标峰面积As回收率/%平均值/%相对标准偏差13.2811.0003.39699.2223.2261.0003.382104.7533.2951.0003.43395.8443.3421.0003.46296.1552.9591.0003.704100.9999.390.037

由表4可知， 5个样品的平均回收率接近100%，且重现性很好，这表明该方法结果可靠.

3 结论

以顺丁烯二酸为内标、D2O为溶剂，建立了片剂中维生素B6的1H-QNMR定量方法.该方法操作简便，测得片剂中维生素B6的平均含量与样品的标示量基本吻合，且测定值在药典规定的标示范围内.多次测量的相对标准偏差小于3%，可见测试结果的稳定性也比较好.通过对维生素B6样品进行加标回收试验，表明测试结果重复性好、精确度高，具有较高的可靠性.