用LC-MS/MS法同时测定栀子中3种环烯醚萜苷类成分的含量

常瑞蕊，陈卫东，周婷婷

(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 233000；2.海军军医大学药学院药物分析教研室，上海 200433)

栀子是茜草科植物栀子(GardeniajasminoidesEllis)的干燥成熟果实,具有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒以及消肿止痛的功效[1]，临床上常用于糖尿病、抑郁症、高脂血症、炎症及绝经后综合征[2-4]。栀子中主要含有环烯醚萜苷类、有机酸酯、黄酮类以及二萜色素等成分[5]。其中，环烯醚萜苷类化合物为主要成分，该类成分具有利胆、保肝、抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种药理活性[6]。

目前，栀子的质量控制多采用高效液相色谱法[7]、超高效液相色谱法[8]或者高效薄层色谱法[9]等对栀子苷、京尼平龙胆双糖苷、山栀苷等环烯醚萜苷类成分进行定量分析，但是上述方法均存在分析时间长、灵敏度和分辨度低等缺点。液质联用(LC-MS)是一种液相色谱与质谱串联的技术，其将液相的高分离效能与质谱的强结构测定功能相结合[10]，其中，串联质谱(MS/MS)具有更高的灵敏度和更强的选择性。因此，本研究采用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法同时测定栀子中3种环烯醚萜苷类成分：山栀苷、栀子苷、京尼平龙胆双糖苷的含量，不仅能缩短分析时间、提高分析效率，而且利用质谱的高分辨率和高灵敏度，对栀子中含量较少的山栀苷进行准确定量，为栀子质量控制提供更全面的依据。

1 仪器与试药

Shinmadzu 8040岛津液相色谱-串联质谱仪(日本岛津公司)，包括两台LC-30A色谱泵，SIL-30AC自动进样器，CTO-30A柱温箱，CBM-20A系统控制器和一台8040三重四级杆质谱仪；CR3i高速冷冻离心机(美国赛默飞公司)；XS205精密天平(梅特勒-托利多国际有限公司)。

栀子药材(上海童涵春堂中药饮片有限公司，产地：江西)。对照标准品山栀苷(批号：17090822，上海同田生物技术股份有限公司)，京尼平龙胆双糖苷(批号：M0502AS，大连美仑生物技术有限公司)，栀子苷(批号：G1910050，上海安谱实验科技股份有限公司，纯度≥98%)；色谱纯乙腈(美国Honeywell公司)，乙酸(美国Tedia公司)；超纯水通过Milli-Q系统在实验室自制。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Dikma Diamonsil®C18色谱柱(100 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相：0.1%乙酸水(A)-0.1%乙酸乙腈(B)。梯度洗脱程序：0～1 min，22%～35% B；1～4 min，35% B；4～5 min,35%～22% B。流速0.4 ml/min，柱温40 ℃，进样体积2 μl，分析时间5 min。结果见图1。

2.2 质谱条件

离子源为电喷雾电离源(ESI)，正/负离子检测，扫描方式为多重反应监测模式(MRM)。正离子检测模式下，京尼平龙胆双糖苷m/z573.40→365.05，碰撞电压：-34 eV；负离子检测模式下，山栀苷m/z391.10→149.30，碰撞电压：28 eV；栀子苷m/z447.30→225.15，碰撞电压：14 eV。雾化气流量3 L/min，干燥气流量15 L/min，脱溶剂管温度 240 ℃，加热块温度400 ℃，碰撞气压力230 kPa。结果见图2。

2.3对照品溶液的制备

分别精密称取山栀苷5.38 mg、京尼平龙胆双糖苷5.16 mg、栀子苷2.50 mg，用初始流动相定容至5 ml容量瓶中，摇匀，分别得到浓度为1.08、1.03和0.50 mg/ml的混合对照品溶液。

2.4 供试品溶液的制备

精密称取栀子药材粉末0.5 g，用50%乙腈定容至10 ml容量瓶中，摇匀，将粗提物以12 000 r/min离心10 min，取上清液，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液，精密吸取续滤液100 μl，用50%乙腈定容至100 ml容量瓶中，得栀子供试品溶液，备用。

2.5 标准曲线的绘制

精密吸取“2.3”项下混和对照品溶液，分别逐级稀释，按照“2.1”、“2.2”项下条件，进样2 μl，记录各对照品的浓度。以各对照品的质量浓度(X，ng/ml)为横坐标，峰面积值(Y)为纵坐标，进行线性回归，得标准曲线方程，山栀苷：Y= 243.810X-289.957，r=0.999 9，线性范围10.76～215.2 ng/ml；京尼平龙胆双糖苷：Y= 137.125X+2 092.76，r=0.999 6，线性范围516～4 128 ng/ml；栀子苷：Y= 2 030.32X+823 213，r=0.999 8，线性范围2 000～20 000 ng/ml。以上结果表明，山栀苷、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷在相应的浓度范围内线性关系良好。

2.6 精密度试验

精密吸取山栀苷、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷浓度分别为53.8、2 064、10 000 ng/ml的混合对照品溶液。按“2.1”、“2.2”项下条件，于同一天重复进样6次，记录峰面积。结果显示山栀苷、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷峰面积的RSD分别为1.33%、0.93%和1.06%，表明该方法精密度良好。

2.7 稳定性试验

取供试品溶液(编号：20180627)，于室温下分别放置0、2、4、6、8 h后，按“2.1”、“2.2”项下条件进样分析，记录峰面积，结果显示，山栀苷、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷峰面积的RSD分别为1.74%、1.09%和0.59%，表明供试品溶液在室温条件下稳定。

2.8 重复性试验

分别精密称取同一批药材粉末0.5 g(编号：20180627,山栀苷、京尼平龙胆双糖苷和栀子苷的含量分别为0.06%、3.76%、12.45%)，按“2.4”项下处理后，按照“2.1”、“2.2”项下条件测定，记录峰面积，平行实验5次，结果显示，山栀苷、京尼平龙胆双糖苷、栀子苷峰面积的RSD依次为1.36%、1.44%、1.88%，表明该方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

精密称取6份已知含量的栀子药材粉末0.5 g(编号：20180627)，按“2.4”项下处理后，按各成分在原药材中的含量，分别精密加入相同含量和浓度的混合对照品溶液，按“2.1”、“2.2”项下条件进行分析，测定回收率。结果见表1。

2.10 样品含量测定

分别称取3批不同批次的栀子样品粉末，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”、“2.2”项下条件测定，每份溶液进样3次，计算山栀苷、京尼平龙胆双糖苷和栀子苷的含量。结果见表2。

图1 3种待测物的MRM色谱图 A.空白乙腈溶剂；B. 3种待测物混合对照品；C.栀子粉末样品1.山栀苷；2.京尼平龙胆双糖苷；3.栀子苷

图2 3种待测物的产物离子质谱图 A.山栀苷；B.京尼平龙胆双糖苷；C.栀子苷

化合物样品量(m/g)原有量(m/mg)加入量(m/mg)测得量(m/mg)平均回收率(%)RSD(%)山栀苷0.500 90.360.400.78103.731.770.500 40.370.400.760.500 20.380.400.770.500 50.400.400.810.500 00.390.400.790.500 40.420.400.82京尼平0.500 920.8620.0042.18102.021.40龙胆双0.500 421.7520.0042.07糖苷0.500 219.7020.0039.990.500 520.0720.0041.810.500021.7920.0041.030.500 422.2220.0040.88栀子苷0.500 969.1465.00135.80102.961.050.500 465.8565.00134.520.500 266.7965.00134.730.500 565.7465.00135.910.500 065.6965.00133.680.500 967.2365.00134.56

表2 不同批次栀子中3种环烯醚萜苷类成分的含量

3 讨论

3.1 检测离子的选择

目前，在国内外关于环烯醚萜苷类成分的质谱检测条件的报道中，一级质谱多以负离子模式下的[M-H]-为主[11-12]。由于不同仪器的响应和灵敏度不同，本实验采用负离子模式对山栀苷和栀子苷进行检测，采用正离子模式对京尼平龙胆双糖苷进行检测。对于一级质谱碎片离子的选择，山栀苷为[M-H]-，栀子苷为[M+CH3COO]-，京尼平龙胆双糖苷为[M+Na]+。在二级质谱中，山栀苷的碎片离子选择[M-H-O-Glu-COOH]-，栀子苷的碎片离子选择[M+CH3COO-Glu-C2H2-OH]-，京尼平龙胆双糖苷的碎片离子选择[M+Na-Glu-CO]+。先前报道表明环烯醚萜苷类成分在二级质谱中糖基易断裂[13-14]，本实验结果与报道相符。

3.2 色谱条件的选择

本实验分别考察了乙腈和甲醇作为流动相中的有机相，发现乙腈作为有机相时，色谱分离效果更好，质谱响应强度更高，为了增强响应值、缩短分离时间，选择乙腈作为流动相中的有机相。同时本实验比较了流动相中添加0.1%甲酸和0.1%乙酸对离子化响应度和分离效果的影响，结果发现流动相中添加0.1%乙酸的离子化响应度以及分离效果更好，故选择0.1%乙酸水-0.1%乙酸乙腈作为流动相。

本实验对LC-MS/MS测定栀子中3种环烯醚萜苷类成分的方法进行了验证。结果表明，该方法具有较宽的线性范围，并且3种物质在此范围内具有良好的线性关系和相关系数(r>0.999)；与此同时，精密度、稳定性、重复性和回收率的RSD均<2%，符合分析方法的要求。以上方法学考察数据显示，本实验建立的方法灵敏可靠，可用于测定栀子中3种环烯醚萜苷类成分的含量。