柠檬桉内生真菌的分离及其提取物的抗细菌活性

单体江 冯皓 谢银燕 邵陈 王军 毛子翎

摘要 ：采用組织块分离法分离柠檬桉中的内生真菌，通过菌落观察和分子生物学相结合的方法对分离到的内生真菌进行鉴定;进一步采用薄层层析生物自显影法测定了柠檬桉内生真菌次生代谢产物的抗细菌活性。从柠檬桉中共分离鉴定得到10株内生真菌，主要分布于附球菌属Epicoccum、镰刀菌属Fusarium、炭疽菌属Colletotrichum、Rhytidhysteron、半壳霉属 Leptostroma、Campylocarpon、Neofusicoccum、白腐菌属Phlebia和Dinemasporium等9个属中。抗细菌活性的测定结果表明，内生真菌Ecf 4（Rhytidhysteron sp.，MK211261）和Ecf 1（Epicoccum sp.，MK211258）表现出最强的抑菌活性，两菌对桉树青枯病菌的抑菌斑最大直径均大于10 mm; 依据其Rf值的范围和抑菌斑的最大直径，内生真菌Ecf 4的抗菌活性高于Ecf 1，表现出更强的抗细菌活性，可作为候选菌株，进一步分离和鉴定其中的活性成分。

关键词 ：柠檬桉; 内生真菌; 次生代谢产物; 抗细菌活性

中图分类号：

S 763.1

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018497

Endophytic fungi isolated from Eucalyptus citriodora Hook. f. and the

antibacterial activity of their crude extracts

SHAN Tijiang， FENG Hao， XIE Yinyan， SHAO Chen， WANG Jun， MAO Ziling

（Guangdong Provincial Key Laboratory for Innovative Development and Utilization of Forest Plant Germplasm， College

of Forestry and Landscape Architecture， South China Agricultural University， Guangzhou 510642， China）

Abstract

The tissue block separation method was used for the isolation of endophytic fungi in Eucalyptus citriodora. Colony observation associated with molecular assay was performed to identify the endophytic fungi isolated from E.citriodora. The antibacterial activities of the crude extracts produced by endophytic fungi were determined by thin layer chromatography bioautography assay. Ten strains in total were identified from E.citriodora. The endophytic fungi mainly belonged to nine different genera， including Epicoccum， Fusarium， Colletotrichum， Rhytidhysteron， Leptostroma， Campylocarpon， Neofusicoccum， Phlebia and Dinemasporium. Endophytic fungi Ecf 4 （Rhytidhysteron sp.， MK211261） and Ecf 1 （Epicoccum sp.， MK211258） displayed the strongest antibacterial activities， and the maximum diameter of the inhibition zones against Ralstonia solanacearum was greater than 10 mm. According to the range of Rf value and the maximum diameter of inhibition zones， the antibacterial activity of endophytic fungi Ecf 4 was stronger than that of Ecf 1. Endophytic fungus Ecf 4 exhibited the strongest antibacterial activity， which could be used as a candidate strain for further isolation and identification of the active components.

Key words

Eucalyptus citriodora; endophytic fungi; secondary metabolites; antibacterial activity

桉树Eucalyptus spp.是桃金娘科Myrtaceae桉树属Eucalyptus植物的总称，天然分布于大洋洲的澳大利亚大陆以及华莱士线以东各岛屿，是目前世界重要的三大速生经济树种之一[12]。桉树是我国林业史上引种最为成功的树种之一，至今已有超过120年的历史，具有重要的经济价值、社会价值和生态价值[24]。近年来随着桉树无性系栽培数量的不断增多以及人工林面积的不断扩大，桉树病虫害的发生也越来越严重[5]，其中桉树青枯病是发病面积最大的病害，目前已成为灾难性的流行病[6]。桉树青枯病的病原是茄劳尔氏菌Ralstonia solanacearum （Smith） Yabuuchi，是一种系统性的维管束病害，也是危害桉树生产的一种毁灭性病害，被称为桉树的“绝症”[7]。目前该病害已在华南地区普遍发生，成为当前桉树林发展的重大障碍，严重威胁着桉树产业的可持续发展[8]。

植物内生真菌能够产生多种结构新颖的次生代谢产物，具有抗细菌、抗真菌、抗氧化、抗肿瘤以及促进植物生长和提高植物抗病性等多种生物活性，是一种新型的天然活性物质资源宝库，从植物内生真菌中寻找具有开发潜能的生物活性物质是近年来的研究热点[911]。而目前对于柠檬桉和桉树内生真菌及其次生代谢产物的报道较少，Kharwar等[12]从柠檬桉中分离得到的曲霉属和毛壳菌属内生真菌表现出较强的抗真菌和抗细菌活性，且抗真菌活性要强于抗细菌活性。格希格图等[13]从不同桉树根部分离到的内生真菌对桉树青枯病菌有不同程度的拮抗作用，其中以大叶桉内生真菌的抗菌活性最为显著。近年来，内生真菌在诱导宿主抗病性方面的研究也越来越受到人们的重视，

能否利用柠檬桉内生真菌及其次生代谢产物来预防和控制桉树青枯病值得进一步研究和探讨。本研究以健康的柠檬桉枝条为研究对象，分离和鉴定其内生真菌，通过大米固体发酵制备其次生代谢产物，并测定次生代谢产物对7种供试细菌的抑制活性，从中筛选出活性菌株，为后续桉树青枯病的防治以及柠檬桉内生真菌资源的综合开发和利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

健康的柠檬桉枝条（两年生）采自广州市天河区华南农业大学树木园。标本的鉴定由华南农业大学林学与风景园林学院郑明轩老师完成。

1.2 仪器与试剂

LRH系列生化培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）;DSX 280KB30手提式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）; SW CJ 2G型超净工作台（苏州净化设备有限公司）;旋转蒸发器OSB 2100（东京理化器械株式会社）;SHZ D3循环水式多用真空泵（广州市臻胜仪器设备有限公司）; HQ45恒温摇床（中国科学院武汉科学仪器厂）;ZF 2型三用紫外仪（上海安亭电子仪器厂）;JA2003N分析天平（上海精密科学仪器有限公司）。

真菌DNA提取试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）;GF254薄层层析硅胶（青岛海洋化工厂）;硫酸链霉素（美国Sigma公司，99%）;噻唑蓝（MTT）生物显色剂（美国Amresco公司）;羧甲基纤维素钠（国药集团化学试剂有限公司）;石油醚、乙酸乙酯、丙酮、甲醇、二氯甲烷等均为国产分析纯（天津富宇精细化工厂）。

1.3 内生真菌的分离、纯化和保存

内生真菌的分离采用Shan等[14]的方法。将柠檬桉枝条用清水洗净，先用75%乙醇處理30 s后，再用0.2%升汞处理20 min，最后用无菌水冲洗3次，每次5 min，以确保残余的乙醇和升汞清洗干净。将表面消毒后的柠檬桉枝条置于无菌滤纸上晾干后，用解剖刀去除表皮并切割成约0.5 cm大小的块段，放置在含500 μg/mL硫酸链霉素的PDA平板上（d = 90 mm），3块/皿，28℃下暗培养，待内生真菌长出后从每个菌落的边缘挑取一小段菌丝接种到新的PDA培养基上，连续纯化多次，直至获得纯培养的菌株。纯化后的菌株于4℃保存，备用。

1.4 内生真菌的鉴定

采用形态学和分子生物学相结合的方法对分离到的内生真菌进行鉴定，形态学的鉴定主要是观察、记录菌落形态并拍照，在光学显微镜下观察菌丝形态特征和产孢情况。分子生物学鉴定采用宋慧云等[15]的方法。通过PDB液体发酵获得内生真菌菌丝，用液氮将菌丝充分研磨至粉末状，采用试剂盒法提取内生真菌DNA，采用真菌的通用引物ITS4（5′ TCCTCCGCTTATTGATATGC 3′）和ITS5（5′ GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG 3′）扩增其ITS序列，PCR反应体系为：2×Taq PCR MasterMix（含染料）25 μL，10 μmol/L ITS 4 和 ITS 5 各1 μL，10 ng/μL模板 DNA 3 μL，双蒸水补足到 50 μL。PCR扩增程序：先在94℃下预变性3 min，然后94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1 min，共30个循环;最后72℃延伸8 min， 4℃ 保存。ITS序列的拼接采用DNAMAN 软件，采用最大似然法用MEGA 7.0.26软件构建系统发育树，将最终的鉴定结果和所得的 rDNA ITS 序列提交到 GenBank 数据库，获得内生真菌菌株的登录号。

1.5 柠檬桉内生真菌次生代谢产物的制备

内生真菌次生代谢产物的制备参照单体江等[16]的方法，发酵培养基为大米固体培养基，培养温度为28℃，培养时间为60 d。采用溶剂冷浸提取法提取内生真菌的次生代谢产物，所用溶剂为乙酸乙酯和丙酮（1∶1），冷浸提取3次，每次7 d，将提取液减压浓缩后即得到其次生代谢产物，4℃保存备用。

1.6 抗细菌活性的测定

采用TLC MTT 生物自显影法测定内生真菌提取物对不同供试细菌的抑制活性[17]。供试细菌包括4种革兰氏阴性菌和3种革兰氏阳性菌，4种革兰氏阴性菌分别为桉树青枯病菌Ralstonia solanacearum、黄瓜角斑病菌Pseudomonas lachrymans、大肠杆菌Escherichia coli和番茄疮痂病菌Xanthomonas vesicatoria;3种革兰氏阳性菌分别为溶血葡萄球菌Staphylococcus haemolyticus、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和枯草芽胞杆菌Bacillus subtilis。通过抑菌斑的迁移率（即Rf值）来初步评价样品中抗菌化合物的极性，根据抑菌斑的大小来初步评价化合物的活性。Rf值计算公式如下：

Rf值=斑点与点样处之间的距离展开剂前沿与点样处之间的距离。

2 结果与分析

2.1 柠檬桉内生真菌的分离和纯化

采用组织块分离法从柠檬桉中分离内生真菌，共分离出内生真菌25株，通过菌落形态观察初步合并相同的菌株，最终分离得到10株形态各异的柠檬桉内生真菌，分别命名为Ecf 1～ Ecf 10，其菌落形态如图1所示。柠檬桉内生真菌菌落大多为规则圆形，气生菌丝发达，多为白色，其中Ecf 4为灰色;Ecf 6边缘新长出菌丝为白色，后期变为黄棕色;除Ecf 4外，其他内生真菌生长迅速，7 d左右即可长满培养皿（直径7.5 cm）。通过光学生物显微镜观察发现，从柠檬桉枝条中分离到的所有内生真菌的菌丝均为有隔菌丝，但多数内生真菌未见产孢，通过形态学很难进行准确鉴定，因此采用分子生物学方法对筛选出的柠檬桉内生真菌进行进一步鉴定。

通过PCR扩增、测序后，使用DNAMAN软件进行拼接，将拼接完整的ITS序列提交至GenBank，获得其登录号，并采用最大似然法构建系统发育树（图2），结合菌落形态和显微观察以及构建的系统发育树，柠檬桉内生真菌最终鉴定结果如表1所示。从柠檬桉中共鉴定出10株不同的内生真菌，主要分布于附球菌属Epicoccum、镰刀菌属Fusarium、炭疽菌属Colletotrichum、Rhytidhysteron、半壳霉属Leptostroma、Campylocarpon、Neofusicoccum、白腐菌属Phlebia和Dinemasporium等9个不同的属中。其中Ecf 3和Ecf 10属于炭疽菌属，但从系统树可以看出，Ecf 3和Ecf 10并没有聚类在同一枝上，说明Ecf 3和Ecf 10分属于炭疽菌属的不同种。

2.2 柠檬桉内生真菌次生代谢产物的抗细菌活性

柠檬桉内生真菌次生代谢产物对桉树青枯病菌和另外6种供试细菌的抑制活性如表2所示。结果表明，所有内生真菌次生代谢产物对桉树青枯病菌均表现出一定的抑制活性，但不同内生真菌的活性强弱存在一定差异。综合抑菌斑的Rf值和最大直径，结果发现内生真菌Ecf 4对桉树青枯病菌表现出最强的抑制活性，其次是内生真菌Ecf 1和Ecf 5，三者抑菌斑的最大直径均大于10 mm。内生真菌Ecf 4的Rf值为0.0～0.74，Rf值主要与化合物的极性有关，Rf值越大，说明化合物的极性越小;此外，Rf值的范围与抗菌化合物的数量有关，Rf值的范围越大，说明抗菌化合物的数量越多，通过Rf值可以看出内生真菌Ecf 4含有的抗菌活性化合物最多，且化合物的极性为中等偏大。内生真菌Ecf 2、Ecf 6和Ecf 9对桉树青枯病菌也表现出一定的抑制活性，抑菌斑的最大直徑在5～10 mm;其余菌株表现出微弱的抑制活性，抑菌斑的最大直径均小于5 mm，Rf值的范围也更小。

通过对其他供试细菌的抑制活性测定结果可以看出，不同内生真菌次生代谢产物对革兰氏阴性菌和阳性菌的抑制活性存在一定的差异，对革兰氏阴性细菌的活性要明显强于革兰氏阳性细菌，仅有3株内生真菌的次生代谢产物对溶血葡萄球菌表现出抑制活性。其中内生真菌Ecf 4、Ecf 1和Ecf 6对6种供试细菌均表现出抑制活性，依据其Rf值的范围和抑菌斑的最大直径可以发现，内生真菌Ecf 4的抗菌活性明显强于Ecf 1和Ecf 6。Ecf 2、Ecf 5、Ecf 9和Ecf 10对除溶血葡萄球菌之外的5种细菌表现出抑制活性，特别说明的是内生真菌Ecf 2对这5种细菌表现出较强的抑制活性，抑菌斑的最大直径均大于10 mm，Rf值的范围甚至大于内生真菌Ecf 4。内生真菌Ecf 3和Ecf 8仅对3种供试细菌表现出抑制活性，Ecf 7的抑制活性最弱，仅对番茄疮痂病菌和大肠杆菌表现出抑制活性，且抑菌斑的最大直径均小于5 mm。综上所述，内生真菌Ecf 4对桉树青枯病菌和其他供试细菌表现出最强的抑制活性，其次是菌株Ecf 1，内生真菌Ecf 4和Ecf 1可作为进一步开发抗菌活性物质的候选菌株。

3 讨论

内生真菌广泛存在于植物的各个部位，但不同植物以及同一植物不同部位内生真菌的种类和数量均存在较大差异[18]。内生真菌的种类还与植株的生长年龄、所处季节以及组织和器官的相对位置等因素有关[19]。本研究从柠檬桉枝条中仅分离、鉴定得到10株不同的内生真菌，可能与寄主植物及其所处的生存环境有关。此外，多数内生真菌并不能在人工培养基上培养，且PDA培养基也不一定是最适培养基，因此本研究中分离到的这10株内生真菌只是柠檬桉内生真菌的一部分。在后续的研究中可以尝试采用不同的培养基并结合高通量测序，分离得到尽可能多的内生真菌，并比较不同培养基内生真菌的分布和生长情况。此外，本研究在制备内生真菌提取物时采用大米固体培养基，发酵时间为60 d，虽然已将大米培养基完全消耗分解掉，且目前尚未见大米培养基中含有抗细菌活性成分，但仍不能排除部分抗菌活性成分来源于培养基的可能性。因此，在以后的研究中应以大米培养基的提取物为空白对照。

内生真菌与其宿主植物在长期的协同进化过程中形成了互利共生的关系，内生真菌不仅可以给植物提供所需的营养物质，还参与植物的防卫机制，增强植物抗逆境、抗病虫害的能力[20]。内生真菌是支撑农林生产的重要的推手，在提高作物产量增强植物抗病性的同时可降低化学农药的使用，从而有利于保护环境和人类健康[21]。部分内生真菌产生的生物活性物质在植物病害生物防治和药物研发等方面表现出了巨大的经济价值和应用前景[22]，本研究从柠檬桉枝条中分离到的内生真菌Ecf 4（Rhytidhysteron sp.，MK211261）和Ecf 1（Epicoccum sp.，MK211258）对桉树青枯病菌R.solanacearum表现出较强的抑制活性，同时对其他供试细菌也表现出一定的抑制活性。目前与Ecf 4和Ecf 1同属的菌株作为内生真菌在多种植物中被报道。Chokpaiboon等[23]研究发现红树林内生真菌Rhytidhysteron rufulum能够产生含有高度氧化侧链的色酮类化合物rhytidchromones A E，该类化合物具有很好的细胞毒活性。Pudhom等[24]发现红树林内生真菌Rhytidhysteron sp. AS21B能够产生一系列的螺二萘类化合物，并测定了对两种癌细胞的细胞毒活性。El Amrani等[25]从苹果薄荷Mentha suaveolens内生真菌Epicoccum nigrum中分離到5个新的聚酮类化合物，部分化合物对蛋白激酶和脱乙酰化酶具有抑制活性。Dzoyem等[26]从榼藤子Entada abyssinica内生真菌Epicoccum nigrum中分离到具有抗氧化、细胞毒活性和抗细菌活性的白僵菌素、对羟基苯甲醛、吲哚 3 羧酸和醌茜等4个化合物。柠檬桉内生真菌Ecf 4和Ecf 1可作为抗细菌活性物质开发的候选菌株，进一步分离和鉴定其中的活性成分，阐明其抗菌机理，为生物农药的大规模开发应用和病害的生物防治奠定基础。

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（责任编辑：田 喆）