代谢组学在肌少症研究中的相关应用

欧洲老年肌少症工作组(EWGSOP)于2010 年将肌少症定义为“一种以进行性骨骼肌肌量和肌力广泛损失引起的肢体功能障碍、生活质量下降和死亡等不良事件风险增加的综合征”[1]。国外大量研究显示:肌少症在老年人群中的发病率约为10%～20%,且其发生率随年龄的增加而增加[2-3]。预计到 2050 年,全球老年肌少症病人将超过 2 亿[1]。到目前为止,肌少症的诊断方法主要依赖于肌肉质量的测定、肌肉强度的评定及肌肉功能的评估[4-5]。但肌少症缺乏特异性的临床表现,无法被及时认识到,且测定、分析及评估过程复杂，主观影响较大,肌少症的诊断仍面临巨大挑战。因此,探明新的肌少症简易诊断指标具有重要意义。

代谢组学(metabonomics)是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后飞速兴起的一门学科,通过单独或联合应用包括核磁共振(NMR)、质谱 (MS) 和多种色谱在内的多种分析化学技术,可以对生物样本中的小分子代谢物(分子量<1000)进行定性或定量分析,进而研究生物体在外界环境刺激、病理生理变化及自身基因突变作用下的内源性代谢产物谱的变化。目前，代谢组学已广泛应用于生物标志物的发现、疾病的早期诊断和预后判断等方面。本文旨在阐述代谢组学在肌少症研究中的进展。

1 代谢组学的研究策略

与“转录组”和“蛋白质组”相平行的“代谢组”,是由生物系统合成的一组代谢物。代谢物是细胞调节过程的最终产物,处于生物系统生化活动的末端,其水平可以体现基因表达和蛋白质的变化对生物系统的调控。代谢组学研究流程包括:纳入研究对象、采集和预处理样本、提取和分离代谢产物、检测代谢产物、分析原始数据、采用生物信息解析等。

1.1 生物样品的采集及预处理 代谢组学常用的生物样品主要以体液、组织为主,样本包括血液、尿液、唾液、脑脊液、肌肉组织等,采集样本时需考虑时间、部位、种类、样品群体、性别、年龄、地域等影响因素。体液样本预处理主要包括固相萃取、液-液萃取等方法,其目的在于去除可能影响结果分析的杂质,对代谢组学后期的分析意义重大。

1.2 代谢组学仪器分析技术 代谢物的检测依赖于各种分析化学技术,其中MS技术与NMR技术应用最广泛。MS技术特异性及分辨率高、样品用量少、分析速度快,可同时对多个化合物进行分离和鉴定,但样品预处理复杂,且在检测过程中难以避免代谢物的损失。MS技术常与气相色谱、液相色谱等技术联用,适用于复杂体系中代谢产物结构的鉴定。NMR技术是一种非破坏性技术,采集样本后可不经预处理直接进样,并具备很好的定性能力。但其灵敏度较MS低,难以保证定量分析的精准度。近年来越来越多的研究者开始关注色谱-质谱联用技术,其集NMR的高分离度、高通量及MS的高灵敏度、专属性于一体,使最终得出的代谢物轮廓信息更全面、更完善,也使各分析技术互相验证结果，进而达到优势互补。

1.3 数据处理技术 数据处理主要包括单变量、多变量2种分析方法[6]。单变量分析法主要用于分析代谢产物间的差异。多变量分析法可实现不同样本间的聚类描述、原始变量中潜在生物标志物的筛选等。

2 代谢组学在肌少症方面的研究进展

目前,国际上已达成共识的肌少症发病原因包括肌肉蛋白质净合成减少、骨骼肌纤维数量下降、细胞氧化损伤及修复受损。肌少症的诊断使用较多的是 EWGSOP 推荐的肌少症筛查策略[1],包括肌肉质量(简称“肌量”)减少、肌肉力量(简称“肌力”)下降及躯体功能减退。其中,四肢骨骼肌质量指数[ASMI,四肢肌量(ASM)/身高2] 低于同种族同性别的年轻健康成人2 个标准差(SD)即为肌量减少,肌力以握力(HGS)为测定指标,躯体功能以寻常步速为测量指标。近年来,国内外学者就肌少症相关的肌量及肌力进行了大量研究,考虑到正常人25岁开始肌肉纤维的体积和质量开始损失[7],为了提供早期代谢标志物,研究者们将相关年轻人群也纳入了研究范围[8],经综合、反复检测,发现了与肌少症相关的新型代谢物及代谢途径。

2.1 氨基酸代谢 大量研究表明,氨基酸可以有效刺激年轻和老年肌肉蛋白质的合成[9-11]。研究者在老化的腓肠肌中测量到20种经典蛋白原氨基酸中的除甘氨酸、丙氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺以外的16种氨基酸分解代谢明显增加,其分解的游离氨基酸代谢成为乙酰CoA进入三羧酸(TCA)循环。在老年人腓肠肌中，泛素蛋白酶体途径较成人活性更大[12],并且该途径可能在禁食状态下随着年龄增长而过度活跃。已被认为是肌肉损伤标志物的3-甲基组氨酸和游离氨基酸在老年人腓肠肌中也被发现有所增多[13]。随着年龄的增长,血浆和肌肉中游离脯氨酸-羟脯氨酸(胶原蛋白的一种二肽成分)、反式-4-羟基脯氨酸(胶原蛋白的一种氨基酸修饰)水平逐渐降低,反映了老化过程中胶原蛋白的更新减少和沉积、交联增加,导致了肌肉僵硬并降低了老年人的关节活动性。在尿液和肌肉中,C-糖基色氨酸[类似于羧甲基赖氨酸(CML)的非酶依赖性晚期糖基化产物]随年龄的增长而增加,而在人群研究中,CML与老年人行走速度缓慢、HGS下降有关。血浆中的支链氨基酸(例如异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸)、非支链氨基酸天冬氨酸和谷氨酸被相继证实与肌量、肌力有一定相关性。肌肉组织富含的赖氨酸(一种必需氨基酸),其代谢产物哌啶酸可以刺激蛋白质合成速率增加,促进赖氨酸对骨骼肌蛋白质转换的影响,与肌量和肌力呈正相关,但与年龄呈负相关,这些发现表明,哌啶酸可能是肌少症的潜在早期标志物[14]。

2.2 糖代谢[15-17]大量研究显示,老年骨骼肌中糖酵解代谢明显减少,包括糖酵解、糖原分解、戊糖磷酸途径中间体的累积。丙酮酸随着年龄的增长而增多,但柠檬酸盐、琥珀酰肉碱(琥珀酰-CoA的替代标志物)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)随年龄的增长而降低。丙酮酸的累积表明，丙酮酸脱氢酶的表达或活性受到损害。有研究显示,丙酮酸脱氢酶和6-磷酸果糖-2-激酶/FBP磷酸酶表达的年龄相关性降低与肌量降低相关[18]。NAD是TCA循环和线粒体生物发生的关键辅助因子,这与线粒体功能障碍的代谢组学特征一致,表明随着年龄增长,肌肉中TCA循环和三磷酸腺苷(ATP)产生受损。另外,随着年龄的增长,腓肠肌中包括富马酸盐、苹果酸盐、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)在内的糖酵解中间体有所减少,但与果糖生成相关的山梨醇、几种戊糖磷酸途径中间体(核糖、核酮糖、核酮糖-5-磷酸和木酮糖-5-磷酸)、糖原中间体(麦芽四糖、麦芽三糖、麦芽糖)随着年龄的增长而增加,这表明随着年龄的增长,肌肉中的葡萄糖代谢逐渐转向山梨糖醇和戊糖途径[19]。在血浆生物标志物中,1,5-脱水葡萄糖醇、2′-脱氧胞苷和焦谷氨酰胺与腓肠肌的代谢水平显著相关。

2.3 脂质代谢[20-25]脂肪可分解生成甘油和脂肪酸,脂肪酸进一步经β-氧化代谢。关于老年腓肠肌的研究显示:线粒体的异常可能会影响β-氧化,导致游离脂肪酸水平增高。已有动物及人体代谢组学研究表明,不完全脂肪酸氧化随着年龄的增长而增长。实验证实，老年腓肠肌中甘油、甘油-3-磷酸盐、3-羟基丁酸盐、胆碱、甘油磷酸胆碱、棕榈油酸酯等单不饱和脂肪酸的水平会随着年龄的增长而增长,这表明老年人脂肪分解增加但相关的组织摄取减少。关于老年人比目鱼肌的相关研究显示,可以改变细胞器膜脂质组学特征，使其适应衰老的多种甘油磷脂(GPL)随年龄的增长呈现出减少的趋势。肉毒碱、低分子量酰基肉碱在两种肌肉中均随年龄的增长呈降低趋势。另外,肌细胞内的脂滴会随着年龄的增长而增加,脂滴的增加易形成脂肪浸润，进而造成游离脂肪酸的累积,这一过程与肌力呈负相关。

3 代谢组学对于肌少症探索的展望

肌少症对老年人健康产生的危害、对医疗健康体系带来的沉重负担已日益凸显,其发病机制、早期诊断、实验室辅助检查、疾病分型与分期、治疗与预后尚在探索阶段,如何更全面、更深入地了解肌少症并予以精准预防和治疗迫在眉睫。代谢组学以复杂生物化学网络的终端产物为研究对象,结合生物信息学分析,可以掌握个体或一群人生理状态的丰富信息,进而更综合地了解整个系统生物学[26]。相比于基因组学、蛋白质组学,代谢组学采样方便,技术通用,无需建立庞大的数据库,可放大基因和蛋白质的变化,在寻找疾病潜在生物标志物、探索发病机制、观察预测功能结果的生物转变方面独具优势[27]。近年来,代谢组学在肌少症领域的研究逐渐受到关注,但多数仅停留在动物实验阶段,动物实验和临床研究存在的巨大差异，该学科本身较高的技术要求以及临床验证方面的难度,使其在肌少症的相关研究中仍面临巨大挑战。如何通过代谢组学发现肌少症的早期生物标志物并进行有效的干预,仍有待进一步探索。