桤木属植物遗传变异研究进展

王泽亮，李佳蔓，黄 振，杨汉波，陈 炙，刑文曦，郭洪英

(四川省林业科学研究院,四川 成都 610081)

桤木属(AlnusMill.)为非豆科固氮树种，根系富含根瘤，能改良土壤，是重要的先锋造林与生态功能树种。桤木属是现存桦木科植物中最原始的属，也是北半球新生代植物区系的重要植物类群，主要分布在欧亚和北美，少见于拉丁美洲与非洲，中国有11种[1～2]。四川省及邻近地区是桤木的一个重要分布区，原生分布有四川桤木、川滇桤木、毛桤木、蒙自桤木，被认为可能是桤木属植物起源与分化的中心[1]，此外，台湾桤木在本地区有一定范围的引种推广。在这一地区，四川桤木(AlnuscremastogyneBurk.)是我国最重要的一个特有种，也是目前国内研究最广泛的一个种，其适应性强、童期短且结实量大、生长迅速，目前适生栽培区域已扩大至长江中下游地区，是我国长江流域退耕还林工程、生态建设工程和混交造林的重要树种。

目前，国内桤木属遗传改良研究主要集中于常规育种方面，对其群体遗传多样性与遗传结构研究较少，影响了其保护与进一步的推广利用。本文系统介绍了国内外桤木属植物在系统发育、染色体、同工酶与DNA分子标记水平上，特别是基于SSR分子标记水平的遗传变异研究现状，以期为桤木属特别是国内区域桤木遗传改良提供参考。

1 桤木属植物系统发育研究

从形态学、解剖学、植物地理学等方面的证据来看，桤木属植物是桦木科中最为原始的类群[3]。在桤木属内的分类上，基于表型性状、古生物学数据等资料，匡可任等将我国现有种分为桤木组和单序组两大类[2]。Furlow则把桤木属植物分为桦桤组、蒙自桤木组和桤木组3个分支类群[4]。而陈之端根据桤木的生态表型性状将其分为四组即桦桤组、蒙自桤木组、桤木组和单序组，并认为蒙自桤木组是最原始的，桤木组是现存的最繁盛的组，单序组是在多变气候下独立发展成的一个分支、仅在西南地区保存下来的一个残遗类群，桦桤组是桤木属中最进化的[1]。

随着分子生物学技术的发展，DNA序列信息也逐渐用于桤木属内的分类上，如Savard等利用rbcL、18s rRNA以及核糖体DNA ITS(Internal transcribed spacer，内转录间隔区)序列，研究了桤木属与桦木属属内的系统发育关系，分析显示桤木属与桦木属都是单系(支)分布，而且同化石数据一致，桤木属与桦木属都显示了较近的分化历史[5]。2004年，Chen与Li测序分析了32份桤木材料的ITS序列，认为其可分为3个亚属(Alnobetula，Clethropsis与Alnus)[6]。在最新的研究中，Gryta等通过Genome skimming策略装配质体基因组与核糖体DNA簇方法研究了桤木属植物系统发育，结果同Chen与Li类似也分为3个亚属，而且Alnobetula亚属最早分化形成单支，但是Clethropsis亚属并没有形成一个单支，而是整体位于Alnus亚属内[7]。因此，桤木属亚属或组的分类，除了利用多种分子生物学数据，还需要充分利用其生态表型性状数据。

桤木属除了分类，其起源与进化历史也一直是相关研究的热点。Murai曾提出桤木属植物起源于日本[8]，任保清与刘军等根据核型数据与细胞学资料也认为桤木属植物起源于东亚日本[9～10]。而Furlow认为桤木属植物起源于亚洲的温带地区[4]，陈之端根据生态表型性状与现代地理分布的分析，认为桤木属植物可能起源于东亚具有周期性干旱的亚热带地区，以四川为中心的中国中部地区是其起源和早期分化的中心，起源之后向东、向西散布，并分别通过白令陆桥和大西洋北极陆桥到达北美[1]。目前，关于桤木属起源中心与进化历史尚未有明确的研究结论，具体起源于哪个地区需要根据分子生物学数据与进一步发掘的化石数据来确认。

2 桤木属遗传变异研究

桤木属植物群体遗传变异研究主要在染色体、同工酶与RFLP、RAPD、AFLP、SSR分子水平开展得较多，这些研究为桤木资源的保护与育种利用提供了参考。

2.1 染色体

在染色体水平上，任保青与刘军首次对桤木属自然分布于中国西南地区的川滇桤木、四川桤木、蒙自桤木、毛桤木进行了细胞学研究，结果显示染色体数目均为2n=56，其中川滇桤木的核型属于2A型，其余均为2B型[10]。随后，饶龙兵等与杨汉波等分别研究明确了灰桤木(A.incana)、欧洲桤木(A.glutinosa)、意大利桤木(A.cordata)、绿桤木(A.viridis)等12个桤木种的染色体数与核型结构[11～12]。

此外，洪德元认为桤木属的染色体基数为x=14[13]，而在Murai报道中x=7，且唯一的二倍体是日本南部的A.inokumae[8]。但在Mandák等[14]与Lepais等的研究中认为欧洲桤木在北非与欧洲存在四倍体群体，其研究中染色体基数使用x=14。染色体计数基数会影响分子数据分析结果，特别是对于通过共显性标记获得的数据，因此桤木属染色体计数基数究竟是x=14还是x=7，以及欧洲桤木、川滇桤木、四川桤木、蒙自桤木、毛桤木等(染色体数目为56)是否是二倍化的四倍体还有需要进一步研究确认。

2.2 同工酶

同工酶研究在二十世纪八九十年代开展得较多，最早是Bousquet等于1987年在A.crispa上开展的，该研究采集了22个群体，筛选了包括16个位点的11个同工酶，分析结果显示群体平均期望杂合度为0.14，所有群体基本符合哈代-温伯格平衡状态，异交率为0.9[15]。随着采样群体区域的扩大，A.crispa群体仍表现出较低的自交率以及特异亚群体结构的缺失，群体间与群体内存在高度的基因交流[16]。在随后对A.rugosa的研究中，也发现了类似的结果，并发现其与A.crispa的遗传距离为0.4，占据不同的生态位[17]。同工酶技术也被应用于对朝鲜半岛桤木资源、包括A.hirsuta与A.japonica的研究，结果显示前者群体间有广泛的基因交流，导致群体分化很小，而后者群体内平均遗传多样性系数为0.207，高于作为对照的A.rugosa与A.crispa，同时Gst=0.095，作者认为群体间有基于种子或花粉的广泛的基因交流，导致群体分化很小[18～19]。

A.maritima为美国濒危树种，目前仅存在3个不连续分布的群体，同工酶分析结果也被用于为其濒危保护提供遗传背景。如Gibson等利用同工酶技术研究了其群体遗传多样性与群体结构，结果显示与广布种A.serrulata相比，A.maritima的遗传多样性低，而近交系数、遗传变异分化均高于广布种，分析显示A.maritima高度片段化的分布是由于其自然栖息地的减少，认为对其区域保护来说，可以使用当地群体作为种子库[20]。

2.3 RFLP、RAPD与AFLP

随着分子生物学技术的发展，DNA分子标记技术也逐渐用于桤木资源的研究。利用PCR-RFLP技术，基于对cpDNA的分析，King与Ferris研究了欧洲桤木在冰河期后发展历史，发现13个高度结构化的cpDNA单倍体型，显示喀尔巴阡山脉可能是欧洲桤木的一个避难地，冰河期后逐渐向北欧与中欧发展[21]。结合cpDNA PCR-RFLP与基因组ISSR技术，King与Ferris进一步研究了在意大利分布区重叠的意大利桤木与欧洲桤木遗传特征，分析结果显示两种桤木有明显的地理结构特征[22]。Hantemirova等利用cpDNA的trnH-psbA、trnS-trnG、psaA-trnS区域序列对俄罗斯远东地区A.alnobetula地理分布进行了研究，发现存在高度的群体分化，认为其在进化历史上片段化分布于冰期避难地[23]。

Huh与Huh利用AFLP技术研究了A.firma的遗传变异，结果发现58.1%的AFLP标记具有多态性，与A.firma风媒、远交、伐桩再生特性相一致，98%的遗传变异存在于群体内[24]。国内也逐渐有桤木DNA分子标记研究的报道，如李洁等对云南省来凤山、高黎贡山、鸡足山、苍山和无量山的蒙自桤木(A.nepalensis)资源进行了RAPD分析，结果表明：蒙自桤木遗传多样性丰富，其中鸡足山居群多样性指数最高，作者认为蒙自桤木的分布及遗传结构与环境区域有密切的关系，区域特点是该种遗传多样性水平的重要因子之一[25]。饶龙兵等构建了桤木属植物的AFLP体系，并通过分析桤木属不同倍性的116份材料，认为种群间及种群内部均具有较丰富的遗传多样性，且种群间的遗传差异大于种群内部的遗传差异[26]。随后，利用AFLP分子标记结合形态学指标，采用UPGMA法进行聚类分析，对桤木属17个种57份材料进行了亲缘关系研究及模糊种鉴定，结果显示形态学聚类与AFLP聚类结果基本一致，但存在一定的差异[27]，说明桤木属植物遗传背景丰富，种的分类应该综合考虑确认。

2.4 SSR分子标记

SSR分子标记具有分布广泛、多态性丰富、稳定、共显性等特点，自从被开发以来，获得了广泛的应用。在桤木属植物SSR研究方面，最早的报道见于2008年Zhuk的研究，其发现15个桦木SSR引物中的8个能从欧洲桤木与灰桤木中扩增到产物[28]。随后，Lance等通过A.maritima富集文库，筛选了19条桤木SSR引物，并可应用于A.maritima与A.serrulata相关研究[29]。同时，研究发现桦木科植物不同属的部分SSR引物也可以用于其他属的SSR分析[30]，该特性也被Mingeot等的研究证实，后者从欧榛SSR引物成功筛选到9条引物，可用于欧洲桤木的遗传多样性分析[31]。使用Lance开发的引物，Jones等人系统研究了A.maritima的遗传多样性、群体结构、交配系统，为其保护生物学提供了理论基础[32～33]。Schrader与Graves利用ISSR技术，结合表型数据，研究了A.maritime3个群体的系统遗传特性，认为已分化为3个亚种，而且Oklahoma群体分化最早，进一步分析认为其可能起源于亚洲，通过白令路桥迁移到北美地区，并曾广泛分布[34]。2011年，Lepais通过鸟枪测序方法对富集SSR序列文库进行测序，获得392个SSR位点，该研究根据48个2碱基重复SSR序列设计引物，筛选确认了12条欧洲桤木SSR引物，其中有10、8条分别在灰桤木与意大利桤木中能够得到应用[35]。随后，这12条引物被用于研究北非地区欧洲桤木后缘群体的种群动态与进化历史，结果发现摩洛哥群体为稀有四倍体群体，比其他的北非群体更古老，在地中海地区仍在进行的气候变化中更具有进化与生态价值[36]。这些SSR引物的开发，丰富了桤木属植物遗传多样性分析工具。

近年来，SSR技术也逐渐应用在研究不同桤木演化进程等方面。例如，在欧洲桤木冰期后的(重)建群扩展历史，SSR分析结果显示在整个欧洲地域水平上存在3个主要的扩展方向，与通常认为喀尔巴阡山脉是冰期避难所不同。同时分析认为重建世系群体相遇多次、且在中欧与斯堪的纳维亚半岛地区形成了高遗传多样性的次生接触群体，而在南欧避难地，欧洲桤木有限的遗传混合使其在气候变化中更易遭受灭绝的危险[37]。在比利时、卢森堡、法国交界地区欧洲桤木保护生物学研究中，Mingeot等通过过SSR与cpDNA方法研究了自然群体与种质资源库的遗传结构，结果发现自然群体无显著分化，自然群体与种质资源库也无显著分化，说明种质资源库代表了自然群体的遗传多样性，可用于种质资源的保护与后续利用[38]。欧洲桤木在非洲存在四倍体群体[36]，在包括欧洲、北非与西亚的大规模欧洲桤木群体起源与地理分化研究中(包括209个群体、2200个个体)，Mandák等结合SSR分型、流式细胞技术、气候模型分析，首次发现了欧洲存在两个地理分隔鲜明的四倍体类群(Iberian Peninsula与Dinaric Alps地区)，基于SSR分析，作者认为这两个类群为同源多倍化起源、且灰桤木并未参与其进化历史，同时分析认为这两个四倍体类群并未参与冰期后该物种中欧与北欧群体的物种建群(重建)[14]。而Vít等通过进一步分析鉴定，认为这两个四倍体群体是与欧洲桤木密切相关的新的四倍体物种，并将其分别命名为A.lusitanica、A.rohlenae[39]。在欧洲极地树种灰桤木冰期后生物地理扩展模式研究中，Mandák等利用SSR与cpDNA方法重建了其系统发育进程，分析认为该树种并不遵从模式树种挪威云杉的建群历史，而且Fennoscandian群体是来源于中欧而不是东欧[40]。结合古植物学数据(化石)，Dering等研究了灰桤木群体的系统地理结构，认为这一树种于末次冰期在欧洲北方避难地幸存，在整个欧洲范围可能存在多个避难地，如西阿尔卑斯山地区、喀尔巴阡山脉西部和东部地区，克隆繁殖能力促进了这一树种在末次冰期的存活，但是也导致了群体遗传多样性的降低[41]。

目前，同工酶、RFLP、RAPD、AFLP与SSR等标记已逐渐应用于桤木属植物群体遗传变异研究，特别是RFLP、RAPD、AFLP与SSR分子标记，由于其利用的是植物DNA，较少受样本材料限制，因此应用的更为广泛。通过这些研究，桤木属植物群体遗传多样性、群体结构、系统发育进程、亲缘关系等已阐释得越来越清晰，有力地促进了桤木属植物的保护与改良利用。但是，桤木属植物属于固氮树种，也是一个重要的生态树种，在对其机理、效应等方面研究较少，限制了其实际的推广。而且目前相关研究主要集中于欧洲桤木(A.glutinosa)与海岸桤木(A.maritima)，对其他桤木研究相对较少。

在国内，目前桤木属遗传改良研究主要集中于其引种、选育、繁育、栽培、生理特性研究等常规育种方面，尽管大部分研究尚处于种源/家系水平上，但是一定程度上促进了其遗传改良进程。如吴际友等论述了桤木优树选择应遵循的基本原则，针对桤木短周期工业用材林(纸浆材)这一选择目标，提出了选择方法与选择标准[42]。杨春惠等通过对6 a生种源对比试验林的观测分析，发现桤木各种源、家系高生长迅速，远远优于江南桤木，并选出5个适宜在湖北省推广发展的桤木种源[43]。龚细娟等在洞庭湖区对25个桤木家系进行造林对比试验，发现有两个家系胸径、树高、单株材积生长量具有明显优势，可作为纸浆材在湖区推广[44]。在形态水平上，朱俊义与陆静梅扫描电镜下首次观察了东北桤木(A.mandshurica)和辽东桤木(A.sibirica)花序和花的形态发生过程，为种的鉴定提供了微形态学依据[45]。陈益泰等引进国外桤木属植物11种54个种源，在浙江富阳进行了育苗和早期适应性观测，结果显示欧洲桤木表现最佳，在夏季高温干旱下未见受害[46]。上述各研究促进了国内桤木属植物遗传改良研究，也表明桤木大多数性状在种源/家系间具有显著差异，因而通过种源/家系的选择，可以获得一定的遗传增益。

群体遗传多样性与遗传结构，是物种长期进化的产物，是其生存适应、发展进化的前提，不仅是保护生物学研究的核心之一，也是进行种质资源遗传改良、培育和利用的基础。在桤木属群体遗传变异研究方面，主要通过表型鉴定方法进行，如陈益泰等通过群体生长与表型性状研究，认为四川桤木种内存在着极其丰富的产地变异和(或)个体变异，并基于果实与木材等8个性状的聚类分析，将种源初步划分为川西南区、川中-西北区、川北区和鄂西-渝东区4个产区，其中川西南产区林木生长和木材品质最佳[47]。王军辉从果实性状、材性性状等方面系统研究了不同四川桤木种源的地理变异，通过引入生态梯度值(EGA)，把桤木划分为盆西北周沿区、盆中区和盆南周沿区3个种源区，并认为盆中区为优质种源区且可能是树种起源的中心地区[48]。上述研究所得出的(优质)种源区划有差异[47～48]，可能是因为基于不同的表型性状，或者是取样范围有差异或样本数太少。

而采用分子标记手段的报道较少，除了上述李洁等对云南蒙自桤木资源进行的RAPD分析，以及饶龙兵等构建的桤木属植物AFLP体系外，仅有卓仁英等建立了RAPD体系，对12个四川桤木种源的群体遗传变异进行研究，从产区划分上支持了上述陈益泰等的研究结果[49]。在SSR分子标记方面，也仅有饶龙兵等基于四川桤木、欧洲桤木、硬桤木转录组数据开发了适用于桤木属树种的SSR标记，目前仅在该文中应用于四川桤木、欧洲桤木、硬桤木等12份材料的遗传多样性检测上[50]，笔者所在研究组也已经开发出四川桤木适用的SSR标记[51]。总之国内桤木属植物群体遗传变异缺乏分子水平上的数据支撑。

3 展望

综上所述，桤木属植物遗传变异研究取得了长足的进步，为其遗传改良奠定了理论基础。但也存在一些问题，需要进一步研究。

(1)桤木属植物染色体计数基数究竟是x=14还是x=7，需要通过核型分析、流式细胞技术等进一步分析确认。

(2)除了欧洲桤木、海岸桤木、四川桤木等研究的热点桤木种，对其他桤木种群体遗传变异研究也应加强，以保护桤木资源的多样性以及提升桤木属遗传改良水平。此外，在群体遗传多样性研究的基础上，桤木属植物核心种质构建研究也应加强，以促进桤木属植物保护效率与水平的提高。

(3)当前桤木属改良的目的主要是作为短周期工业原料林或用材林，对其生态效益关注度不足，对其固氮机理以及不同种、不同群体的生态效应等方面需要进一步加强研究。

(4)就笔者所在四川及邻近地区来说，本地区天然分布有四川桤木、川滇桤木、毛桤木、蒙自桤木，这一区域面积虽然不大，但自然条件复杂、地理及气候类型多样，桤木资源可能存在着广泛的遗传变异，但是尚未利用分子手段进行过系统的研究。同时不同种分布区域有差异，部分种有重叠，如四川桤木主要分布在丘陵区与盆周山地地区，而川滇桤木、蒙自桤木主要分布在川西南山地，其系统地理分布格局是怎样形成的？是否是青藏高原隆起导致的地理分布差异？这些也尚未进行研究。笔者所在研究组正在着手利用SSR标记对其群体遗传变异进行分析研究，以期在清晰了解遗传变异的基础上，推动区域桤木属植物遗传改良研究。