玉米芯对平菇菌丝体生长和胞外纤维素酶活性的影响研究*

龚 娜，刘国丽，陈 珣，曹 君，杨 镇，张 敏，马世宇，

（1.辽宁省农业科学院食用菌研究所，辽宁 沈阳 110161；2.葫芦岛农函大玄宇食用菌野驯繁育有限公司，辽宁 兴城 125125）

平菇（Pleurotus ostreatus） 是全球栽培面积和消费量最大的食用菌之一[1]，由于近年来我国平菇生产规模的逐步扩大，使得栽培平菇的基质日趋紧张，玉米芯资源丰富，可替代木屑，且其价格较棉籽壳、木屑便宜，是栽培平菇主要培养原料之一[2-3]。玉米芯易于就地取材，可实现废弃物利用，并且含有丰富的蛋白质、糖和纤维素等[4]。平菇菌丝在生长发育中通过分泌多种胞外酶将基质中的纤维素、木质素等水解成小分子物质作为主要碳素营养[5]，其生长分化与分泌胞外纤维素酶的能力大小密切相关[6]。

不同平菇菌株对原料的利用和转化效果有很大差异，菌种是制约食用菌生产的关键因素[7]，不同菌株在玉米芯基质上的分解能力不同，成为平菇基质利用的主要障碍。传统的菌株筛选方法是利用栽培试验，周期长，所需空间大，操作过程复杂，成本高[8]。本研究采用平皿法、刚果红杯碟快速筛选法对18株平菇菌株在以玉米芯为营养源的培养基上进行生长和降解效果的筛选，以期筛选出适于玉米芯栽培的高产胞外纤维素酶的优势平菇菌株，为平菇遗传育种筛选高酶活菌株提供科学依据，对提高平菇综合生产能力起到重要作用。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 供试菌株

供试菌株为辽宁省农业科学院食用菌研究所试验室引种保存的18个平菇菌株，如表1所示。

表1 供试菌株Tab.1 Strains of Pleurotus ostreatus used in the study

1.1.2 培养基

PDA培养基：葡萄糖2%、马铃薯20%、琼脂1.5%，采用自来水配置，pH 7.0。

玉米芯培养基：玉米芯5%、琼脂1.5%，采用自来水配置，pH 7.0。

刚果红-羧甲基纤维素钠培养基[9]：羧甲基纤维素钠 2.0 g·L-1、MgSO4·7H2O 1.88 g·L-1、KH2PO40.5 g·L-1、蛋白胨 2.0 g·L-1、刚果红 0.25 g·L-1、琼脂粉15 g·L-1，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 测量和统计

菌种活化：取出保藏在冰箱中的母种，在超净工作台上接种试管斜面PDA培养基，每个菌株接种3支，23℃培养5 d。

原种的扩大培养：6 d后选取生长状况最好的活化菌株，在超净工作台上接种到PDA平板正中央，以保证菌落边缘连续，菌丝生长均匀。23℃培养8 d，每个菌株3次重复。

打孔接种：培养8 d后选取菌丝生长一致的平板，在超净工作台上用无菌打孔器在与平板中央距离相同位置上打孔，接种到玉米芯培养基平板中央，23℃培养8 d，每个菌株3次重复。

刚果红染色法[10-12]：用打孔器（直径约5 mm）将单菌落接种至CMC-Na平板培养基中，30℃恒温培养8 d，然后观察变色圈的大小，用游标卡尺测菌落直径d（mm） 和变色圈直径D（mm）。

1.2.2 数据分析

菌丝生长速率测定：接种第3天开始，每隔1 d通过十字划线测定菌落直径，精确到毫米，记录时间和生长量，每个菌株3次重复。

菌丝生长指数[13]：菌丝生长指数为菌丝长势评分乘以菌丝生长速率（mm·d-1）。

菌落直径：培养7 d之后测量的菌落直径。

菌丝长势：设定5为旺盛，4为较旺盛，3为长势一般，2为长势较差，1为长势最差。

酶指数采用EI表示，EI=D/d。

采用SPSS软件进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 玉米芯培养基对不同平菇菌株菌丝生长的影响

玉米芯培养基对不同平菇菌株菌丝生长的影响见表2。

由表2可见，18种平菇在玉米芯培养基上均可生长，但其菌丝生长速率、长势评分、菌落直径、菌丝生长指数间有较大的差异，其中10号菌丝浓密、粗壮、生长旺盛，生长速率、菌落直径、生长指数最大。菌株长势情况，10号、2号、12号生长旺盛，菌株生长速度最快，5号、6号、8号、9号、15号、18号菌株次之，较旺盛，1号、4号、14号、16号、17号长势一般、生长速度慢，13号长势较差，3号、7号、11号长势最差。综合各项生长指标得到平菇在玉米芯培养基上生长状态的排序为10号＞2号＞12号＞15号＞6号＞9号＞18号＞5号＞8号＞1号＞4号＞16号＞14号＞17号＞13号＞7号＞3号＞11号。

2.2 不同平菇菌株在玉米芯培养基上的菌丝生长曲线

不同平菇菌株在玉米芯培养基上的菌丝生长曲线见图1。

表2 玉米芯培养基对不同平菇菌丝生长的影响Tab.2 Effect of corncob medium on mycelium growth of Pleurotus ostreatus

图1 平菇在玉米芯培养基上的菌丝生长曲线Fig.1 Growth curve of Pleurotus ostreatus on the corncob medium

由图1可见，18种平菇菌株在玉米芯培养基上的生长曲线可以分为5组：10号、2号、12号菌丝生长曲线为一组（第1组），5号、6号、8号、9号、15号、18号菌丝生长曲线为1组（第2组），1号、4号、14号、16号、17号菌丝生长曲线为1组（第3组），13号菌丝生长曲线为1组（第4组），3号、7号、11号菌丝生长曲线为1组（第5组）。从菌丝生长曲线的变化趋势可见，第1组10号、2号、12号菌丝的生长效果最好，菌丝萌发快，随着培养时间的增加，菌丝生长指数呈直线上升趋势，而且上升幅度比较大。第2组与第3组菌丝生长曲线非常接近，其生长明显低于第1组，但明显高于第4组和第5组。

2.3 刚果红染色法快速筛选高产纤维素酶平菇菌株

刚果红染色法快速筛选高产纤维素酶平菇菌株，结果见表3。

由表3可知，降解的羧甲基纤维素钠不再与刚果红结合形成红色复合物，通过刚果红染色法获得其水解纤维素酶能力，结果表明平菇菌株的菌落周围均可产生透明圈，均能够显现羧甲基纤维素钠的酶活。其中10号菌株（3302）变色圈出现较早，变色圈更大，变色圈直径为41.67 mm。结合酶指数可以筛选出降解效果较好的菌株为10号菌株（3302），其降解纤维素的能力最强。

表3 刚果红染色法快速筛选高产纤维素酶平菇菌株Tab.3 Cellulose-degrading Pleurotus ostreatus screened by congo red saucer rapid screening method

3 结论与讨论

平菇适应性广、栽培方法简单，多种作物秸秆均可作为基质生产平菇[14-16]。随着栽培面积的增加，棉籽壳、木屑资源紧缺，容易造成“菌林矛盾”等生态环境问题，栽培成本也随之攀升。玉米芯属于农业废弃物，对于木屑较少、玉米芯较多的栽培区域，既可降低培养成本，又能充分利用资源，使其变废为宝，提高经济效益。食用菌胞外酶活性的变化因菌种和酶的不同而有所不同，但其变化也有一定的规律性，并且能够较直接反映出食用菌对培养基质的降解情况[17]，平菇整个生长周期和酶活的变化趋势与菌丝生长势基本相同[18]。目前，我国已有对平菇营养生理的研究，但对平菇多种不同菌株胞外纤维素酶对比鲜有报道。筛选高效纤维素降解菌株是高效利用纤维素类物质的关键，纤维素酶活力是评价菌株降解纤维素能力的重要指标[19]。优势平菇菌株是产业发展的基础，能极大地提升栽培效益。以栽培的方式设计玉米芯含量不同的培养料配方的研究方法受到培养条件的限制，需要的空间大，周期长。本研究以玉米芯为营养源，采用平板法快速筛选适于玉米芯栽培的平菇菌株。结果表明，在含玉米芯的培养基上，18株平菇菌株菌丝均能生长，但是菌丝生长曲线差异较大，菌株3302、9408和抗病2号菌丝长势较好，3302长势最好，菌丝生长速率和菌丝生长指数分别为11.28 mm·d-1和56.39，变色圈最大，直径为41.67 mm。今后可在本试验基础上对所筛选出的优势菌株进行代料栽培，进行培养料与子实体的相关性的研究等，此试验也为今后选育适合玉米芯栽培的平菇菌株提供了亲本菌株参考。