蚕蛹油对庆大霉素致大鼠肾脏损伤的保护作用

周静 曾艳 杨柳 张莉 罗来敏 魏昕 王瑜 李秋月 程斌

(1南昌大学第一附属医院肾内科，江西 南昌 330006；2浙江医药高等专科学校)

庆大霉素是一种氨基多糖体的抗生素，主要用来对抗革兰阴性菌的感染；然而，在临床上常会产生肾毒性等副作用。氧化性压力可能与庆大霉素造成的肾毒性有关〔1～3〕。蚕蛹油脂中含有大量不饱和脂肪酸甘油酯，在体内能水解为人体必需的油酸、亚油酸及亚麻酸等不饱和脂肪酸。蚕蛹油具有增加生物膜液体性、舒张血管、抗血栓形成、降低血浆总胆固醇、抗血小板聚集等药理作用。本研究主要探讨蚕蛹油对庆大霉素引起大鼠肾脏伤害的保护作用。

1 材料与试剂

1.1动物 SD大鼠70只，雌雄过半，体重(200±50)g，由浙江省医学科学院实验动物中心提供，合格证号0012051。饲养室温控制在25℃，相对湿度为75%；每只实验动物自由饮水，喂饲普通饲料。

1.2实验试剂及仪器 蚕蛹油(江苏南通福尔生物)；庆大霉素(福建古田药业)；尿素氮(BUN)、肌酐(CREA)试剂盒(宁波美康)；丙二醛(MDA)-586测定试剂盒(美国OXIS)；甲醇(Merck)；盐酸(Merck)；乙醚(Merck)；格里斯试剂(Griess reagent,Sigma)；乙二胺四乙酸(EDTA)；羟吲哚βD葡萄糖苷酸(indoxyl βD-glucuronide,Sigma)；3-氨基苯二甲酰肼(luminol,Sigma)；硝酸双-N-甲基吖啶翁(Lucigenin,Sigma)；Tris-HCl(Merck) 。

DRII-CHEM 3500s血液生化分析仪(日本Fujifilm)；CX21BIM-SET6光学显微镜(奥林巴斯)；CLA-2100高效能化学发光分析仪(日本Tohoku)；Micro21/21R离心机(美国Thermo)；ESB-500室高剪切均质乳化机(上海易勒机电)；G9双光束紫外可见分光光度计(美国菲勒)。

1.3方法

1.3.1动物分组及给药 70只SD大鼠分成7组，每组10只。第1组为正常组，大鼠每天按照1 ml/kg皮下注射去离子水，同时按照1 ml/kg灌胃给予去离子水，连续1 w。第2组为模型组，大鼠每天按照100 mg/kg皮下注射庆大霉素，连续1 w。第3～7组为给药组，大鼠每天按100 mg/kg皮下注射庆大霉素，同时灌胃给予0、1、2、4、8 ml/kg剂量的蚕蛹油，连续1 w。

1.3.2指标检测 给药末日当晚禁食不禁水12 h，次日上午，各组大鼠乙醚麻醉后，从股静脉抽取1.5 ml血液并放入血清分离管中，静置30 min，4℃ 12 000 r/min离心10 min，取上层血清。采血后，迅速取出肾脏，生理盐水清洗后，立刻在室温下浸泡在4%的甲醛中固定，供肾组织病理学检查用。

1.3.2.1血生化指标 BUN及CREA为肾功能的评估指标，采用全自动血液生化分析仪进行分析。

1.3.2.2肾脏脂质过氧化检测 取约200 mg肾脏，0.9%生理盐水冲洗，加Tris-HCl缓冲液(20 mmol/L，pH7.4)进行均质化，4℃ 12 000 r/min离心30 min。吸取200 μl上层液，按MDA-586测定试剂盒说明书进行MDA含量分析，586 nm波长处测量其吸光值。

1.3.2.3肾脏中羟自由基、过氧亚硝酸盐及超氧阴离子含量测定 取约200 mg大鼠肾脏，加入Tris-sucrose缓冲液(0.25 mol/L蔗糖溶液加入到含1 mmol/L EDTA的20 mmol/L Tris-HCl缓冲液中，pH7.4)进行均质，4℃ 12 000 r/min离心30 min。取400 μl 上清液与 200 μl 生理盐水混合后置入化学发光分析仪中分析，分别注入17 mmol/L indoxyl βD-glucurinide和luminol各100 μl，测量羟自由基、过氧亚硝酸盐及超氧阴离子含量，用化学发光分析仪数据采集软件(CLA-DAS) 计算待测样品含量。

1.3.2.4肾脏中一氧化氮(NO)含量测定 取约200 mg大鼠肾脏，加去离子水进行均质，4℃ 12 000 r/min离心30 min；取100 μl 组织上清液与100 μl Greiss reagent(40 mg/ml)混合，然后加入800 μl 的去离子水；550 nm波长处测量该样品之吸光值，计算NO含量。

1.3.2.5肾脏病理检测 将固定好的肾组织HE染色后，在光学显微镜下观察肾组织病理情况，评分标准：细胞浸润得1分、丧失边缘绒毛得1分、细胞质空泡化得1分、细胞肿胀得1分、细胞坏死得2分。 至少观察10个视野以客观纪录组织伤害严重程度。根据上述评分标准计分，得分越高表示伤害程度越高。

1.4统计学分析 采用SPSS20.0统计学软件行ANOVA分析。

2 结 果

2.1各组血生化指标水平比较 与正常组相比，模型组的血清BUN及CREA水平显著升高(P<0.05)；与模型组相比，蚕蛹油2～8 ml·kg-1·d-1能显著降低血清BUN及CREA水平(P<0.05)。见表1。

2.2各组肾脏脂质过氧化水平比较 与正常组相比，模型组的肾脏MDA水平显著升高(P<0.05)；与模型组相比，蚕蛹油2～4 ml·kg-1·d-1能显著降低肾脏MDA水平(P<0.05)。见表1。

2.3各组肾脏中羟自由基含量测定 与正常组相比，模型组肾脏中羟自由基的含量显著升高(P<0.05)；与模型组相比，蚕蛹油2～8 ml·kg-1·d-1能显著降低肾脏中羟自由基的含量(P<0.05)。见表1。

2.4肾脏中过氧亚硝酸盐含量测定 与正常组相比，模型组肾脏中过氧亚硝酸盐的含量显著升高(P<0.05)；与模型组相比，蚕蛹油2～8 ml·kg-1·d-1能显著降低肾脏中过氧亚硝酸盐的含量(P<0.05)。见表1。

2.5肾脏中超氧阴离子和NO含量测定 与正常组相比，模型组肾脏中超氧阴离子和NO的含量显著升高(P<0.05)；与模型组相比，蚕蛹油2～8 ml·kg-1·d-1能显著降低肾脏中超氧阴离子含量，差异有统计学意义(P<0.05)。蚕蛹油2～8 ml·kg-1·d-1虽然能降低肾脏中NO的含量，但差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.6肾脏病理检测 肾组织病理切片结果显示，庆大霉素会造成大鼠肾脏中肾小管的坏死，而肾小球没有任何异常。正常组大鼠肾脏中呈现较完整的肾小管形态，模型组大鼠可以明显找到肾小管的病变区域(箭头处)，而各剂量蚕蛹油给药组没有显著的肾小管病变。将损害程度给予评分之后，给予蚕蛹油2～8 ml·kg-1·d-1处理，其得分均显著低于模型组(P<0.05)，表示蚕蛹油能够有效降低庆大霉素造成的大鼠肾脏组织损伤。见表1和图1。

表1 各组血BUN、CREA水平及肾脏MDA、羟自由基、过氧亚硝酸盐、超氧阴离子、NO含量及肾组织病理评分比较

与正常组比较:1)P<0.05；与模型组比较:2)P<0.05

Ⅰ：正常组；Ⅱ：模型组；Ⅳ～Ⅶ：蚕蛹油1、2、4、8 ml·kg-1·d-1组图1 蚕蛹油对各组大鼠肾组织病理的影响(×400)

3 讨 论

本实验探讨了蚕蛹油对庆大霉素致肾脏伤害的保护作用，结果显示，每天给予一定剂量的蚕蛹油可减缓庆大霉素造成的肾脏伤害。本实验结果表明，蚕蛹油能减少肾脏中羟自由基、过氧亚硝酸盐、超氧阴离子及一氧化氮的生成。羟自由基及过氧亚硝酸盐在脂质过氧化反应及器官衰竭中扮演相当重要的角色〔4，5〕。羟自由基会攻击多元不饱和脂肪酸，使细胞产生氧化连锁反应，是造成氧化性伤害的重要物质。羟自由基及过氧亚硝酸盐可能是庆大霉素引发氧化性伤害的关键因子；又由于羟自由基可以借由过氧亚硝酸盐分解而来，所以，推测蚕蛹油也可因为抑制过氧亚硝酸盐的形成，进而降低脂质过氧化反应。而过氧亚硝酸盐又是由超氧阴离子及NO不断反应所产生〔6〕,所以蚕蛹油也可能因为抑制NO及超氧阴离子生成，进而减少过氧亚硝酸盐含量。

本研究发现，灌食大鼠低剂量的蚕蛹油(2、4 ml·kg-1·d-1)能产生明显的抗氧化作用，而高剂量的蚕蛹油(8 ml·kg-1·d-1)作用不明显。蚕蛹油含有极丰富的多元不饱和脂肪酸，虽然多项研究表明多元不饱和脂肪酸是构成细胞膜及维持身体功能的主要物质之一〔7〕，可以调节免疫反应并具有抗炎作用〔8〕，然而多元不饱和脂肪酸本身也是最容易被自由基攻击而产生过氧化反应的物质〔9〕；且经过研究证实，体内累积太多多元不饱和脂肪酸可能会增加氧化性压力〔10，11〕。因此，当大鼠经庆大霉素诱导而产生氧化性压力时，灌食高剂量的蚕蛹油，其中多元不饱和脂肪酸也是受到氧化性攻击的主要目标物质。所以，体内累积过多的多元不饱和脂肪酸，反而会增加脂质过氧化反应。因此，蚕蛹油的使用并不是越多越好，在安全剂量下使用蚕蛹油才能有效降低氧化压力，进而减缓肾脏的伤害，大量使用并不会带来更好的效果。本实验结果为临床上使用蚕蛹油提供了参考的剂量，故建议临床使用时剂量应设定阈值。