黄芪多糖对镉染毒大鼠免疫功能损伤及氧化应激损伤的保护作用

安方玉 颜春鲁 刘永琦 伍志伟 苏韫 高军太

(1甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2甘肃省高校重大疾病分子医学与中医药防治研究省级重点实验室；3平凉市中医医院)

当前，随着工业的发展，金属镉污染逐渐成为威胁人类健康的重要危险因素之一〔1〕。因此，对镉污染造成机体多器官多系统的损伤也备受关注〔2〕。有相关研究报道，镉污染机体后会造成脂质过氧化损伤和免疫损伤〔3,4〕，但具体机制未明。黄芪作为甘肃的道地药材，有大量研究证实，其具有良好的抗氧化、增强机体免疫力等功能〔5～8〕。为此，本实验建立大鼠镉染毒模型，通过观察黄芪提取物黄芪多糖对染镉大鼠免疫功能及氧化功能的影响，初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 SPF级Wistar大鼠36只，体重(180±20)g，雌雄各半，由甘肃中医药大学科研实验中心提供。实验动物质量合格证编号：SCXK(甘)2011-0001-0001344。

1.2主要试剂 氯化镉(天津市巴斯夫化工有限公司，批号：20081010)；羧甲基纤维素钠 (天津市大茂化学试剂厂，批号：110311)；考马斯亮蓝试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号：20140309)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所，批号分别为：20160621、20160627、20160820、20160721、20160728)；鼠白细胞介素(IL)-2酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒和鼠转化生长因子(TGF)-β ELISA试剂盒(上海源叶生物科技有限公司，批号分别为20160718A和201600721A)。

1.3实验药物及给药剂量 药材选用甘肃地道药材黄芪，由甘肃中医药大学科研实验中心药物制剂实验室提取、分离、鉴定(纯度达到50%以上)。黄芪多糖给药量：20 mg/kg，用0.5%的羧甲基纤维素配成所需浓度(2 mg/ml)(批号：GR20120920AS2)。

1.4主要仪器 全自动酶标分析仪(美国Bio-Rad公司，型号iMark)；电子天平(上海精密科学仪器有限公司，型号FA2004N)；ZY12306型微量加样器(ScienTiFic产品)；T6新悦-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；TDZ5-WS型医用离心机(湖南平凡科技有限公司)。

1.5动物分组、造模及给药 SPF级Wistar大鼠36只，雌雄各半，体重(180±20)g，适应性喂养3 d后，按照随机数字表法分为3组：空白对照组、模型组、黄芪多糖组。每组12只。 空白对照组腹腔注射0.9%NaCl，模型组和黄芪多糖组均腹腔注射0.1%氯化镉，按1.5 mg/kg注射，相当于1.5 ml/kg，每周5次，共5 w。染毒的同时给予黄芪多糖(20 mg·kg-1·d-1)灌胃治疗，每天1次，连续5 w。末次给药后，取血，脾脏、胸腺备用。

1.6镉染毒大鼠体重及免疫器官指数的测定 末次给药24 h后，称量大鼠体重，股动脉采血处死大鼠，摘取脾脏、胸腺等组织称重，分别计算脾脏指数及胸腺指数。脾脏(胸腺)指数=脾脏(胸腺)质量(mg)/体重(g)。

1.7脾淋巴细胞转化实验 常规制备脾淋巴细胞悬液，调整细胞数为1×106/ml，设立Con A 刺激组和对照组。Con A 刺激组和对照组均加入100 μl脾细胞悬液，其中Con A 刺激组加入10 μl Con A(终浓度为5 μg/ml)，对照组加入10 μl含血清 RPMI1640培养液，培养箱中培养68 h。每孔加入10 μl MTT(终浓度为5 mg/ml)，继续培养4 h，离心、弃上清，每孔加入150 μl DMSO裂解液溶解，振荡混匀。于570 nm处读取各孔OD值，计算淋巴细胞转化OD值和刺激指数(SI)。淋巴细胞转化OD值=(实验组孔OD值-对照组孔OD值)，SI=实验组孔OD值÷对照组孔OD值×100%。

1.8NK细胞杀伤活性检测 常规制备脾淋巴细胞悬液，调脾细胞浓度为2×106/ml，K562细胞浓度为1×105/ml，设立对照组和靶细胞组。对照组和靶细胞组均每孔加入 50 μl K562 细胞悬液，培养1 h后，靶细胞组每孔加入50 μl脾细胞悬液，对照组每孔加50 μl完培。在培养箱中培养20 h后，每孔加入10 μl MTT(终浓度为5 mg/ml)，继续培养4 h，离心、弃上清，每孔加入150 μl DMSO，振荡混匀。测定570 nm处各孔的A值，计算NK杀伤率。NK杀伤率=〔(靶细胞A值-对照组A值)÷靶细胞A值×100%〕。

1.9脾脏白细胞介素(IL)-2和转化生长因子(TGF)-β1含量的测定 ELISA法测定脾脏IL-2及TGF-β1的含量，具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.10脾脏SOD活性和MDA含量的测定 制备脾脏匀浆液，1 500 r/min离心，15 min，取上清，比色分析法测定脾脏抗氧化酶SOD活性和氧化产物MDA的含量，具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.11血清AST、ALT、LDH活性的测定 大鼠末次给药24 h后，动脉采血5 ml，注入试管内，静置2 h，3 000 r/min离心，10 min，分离血清，比色分析法测定血清中AST活性、ALT活性和LDH活性，具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.12统计学方法 采用SPSS17.0统计软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1黄芪多糖对镉染毒大鼠体重、胸脾指数的影响 与空白对照组比较，模型组大鼠体重、胸脾指数显著降低(P<0.01)。与模型组比较，黄芪多糖组大鼠体重、胸脾指数显著增加(P<0.05)。见表1。

表1 各组体重、脾脏指数及胸腺指数比较

与空白对照组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.05

2.2黄芪多糖对镉染毒大鼠淋巴细胞转化能力的影响 与空白对照组比较，模型组大鼠淋巴细胞转化能力及刺激指数(SI)显著降低(P<0.05或P<0.01)。与模型组比较，黄芪多糖组大鼠淋巴细胞转化能力及SI显著增加(P<0.05或P<0.01)。见表2。

表2 各组淋巴细胞转化OD值及SI比较

与空白对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较：3)P<0.01

2.3黄芪多糖对镉染毒大鼠NK细胞杀伤活性的影响 与空白对照组比较，模型组大鼠NK细胞杀伤活性明显降低(P<0.01)。与模型组比较，黄芪多糖组大鼠NK细胞杀伤活性显著增加(P<0.01)。见表3。

2.4黄芪多糖对镉染毒大鼠脾脏IL-2和TGF-β1含量的影响 与空白对照组比较，模型组大鼠脾脏组织IL-2含量显著降低，TGF-β1含量显著升高(P<0.01)；与模型组比较，黄芪多糖组脾脏组织大鼠IL-2含量显著增加，TGF-β1含量显著降低，差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。见表4。

2.5黄芪多糖对镉染毒大鼠脾脏SOD和MDA的影响 与空白对照组比较，模型组大鼠脾脏组织SOD活性显著降低，MDA含量显著升高(P<0.01)；与模型组比较，黄芪多糖组大鼠脾脏组织SOD活性显著增加，MDA含量显著降低(P<0.01)。见表5。

2.6黄芪多糖对镉染毒大鼠血清AST、ALT和LDH的影响 与空白对照组比较，模型组大鼠血清AST、ALT、LDH活性均显著升高(P<0.01)；与模型组比较，黄芪多糖组大鼠血清AST、ALT、LDH活性均显著降低(P<0.05或P<0.01)。见表6。

表3 各组NK细胞杀伤活性比较

与空白对照组比较:1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较:3)P<0.05，4)P<0.01

表4 各组脾脏IL-2和TGF-β1含量比较

与空白对照组比较:1)P<0.01；与模型组比较:2)P<0.05，3)P<0.01，表6同

表5 各组脾脏SOD活性和MDA含量比较

与空白对照组比较:1)P<0.01；与模型组比较:2)P<0.01

表6 各组AST活性、ALT活性和LDH 活性比较

3 讨 论

镉是一种银白色有光泽的重金属，有延展性和韧性，广泛存在于自然界中。镉可通过水、食物、密切接触等多种途径进入机体，其工业生产所造成的环境污染通过食物链进入体内为主要途径。镉对肾、肺、肝、睾丸、脑、骨骼及血液系统均可产生毒性，被美国毒物管理委员会列为第6位危及人体健康的有毒物质。有研究显示〔9〕，镉不但能与SOD 中的二价金属离子发生竞争性替代作用，抑制 SOD的活力，也能够促进体内自由基的产生而不断消耗SOD。同时，镉也可与体内含有巯基的抗氧化物及抗氧化酶结合，从而导致脂质过氧化作用增强〔10〕。黄芪作为甘肃的道地药材，其根入药，味甘、性温，有补气益气、补气升阳、固表止汗、托毒排脓等功效。黄芪的活性成分黄芪多糖具有增强和调节机体免疫功能、抗氧化、抗疲劳、抗肿瘤等作用〔11～15〕。

胸腺与脾脏是机体重要的免疫器官，其结构正常与否直接影响机体的免疫功能，胸腺指数与脾脏指数的高低变化可以反映机体的免疫功能状态〔16〕。而淋巴细胞转化实验和NK细胞杀伤实验则是另外一种反映机体的细胞免疫功能和非特异性免疫功能的常用指标〔17〕。此外，IL-2和TGF-β1在免疫功能的调节上属于一对截然相反的指标。IL-2是机体正向免疫调节中最重要的细胞因子之一，主要由T淋巴细胞分泌，其功能是促进T、B淋巴细胞的增殖〔18〕。 TGF-β1 可能是免疫系统关闭的信号之一，其可以抑制所有淋巴细胞的增殖与功能〔19〕。

本研究结果提示黄芪可能是通过抑制镉致大鼠体内脂质过氧化反应，增强其机体的抗氧化能力，进而降低机体的氧化应激水平来减轻镉对机体造成的损伤。同时，本实验结果也表明，镉染毒之后，机体的免疫功能受损，黄芪总苷可能是通过调节机体免疫增强因子IL-2和免疫抑制因子TGF-β1的含量，从而纠正和改善机体的细胞免疫功能和非特异性免疫功能。因此，镉中毒可以引发机体氧化和抗氧化之间的动态失衡，也可以引发机体发生免疫功能紊乱。而黄芪的机制可能通过提高机体的抗氧化能力，增强机体的免疫力，最终达到拮抗镉毒性的目的，但其具体机制尚需进一步研究。