药食同源作物苦荞分子生物学研究进展

时小东，吴 琪，谭茂玲，赵 钢

(1.成都大学 农业农村部杂粮加工重点实验室，四川 成都 610106；2.成都大学 药学与生物工程学院，四川 成都 610106)

0 引 言

苦荞为一年生草本双子叶植物，其在《本草纲目》、《齐民要术》及《神农书》等古籍中均有记载，为一种药食兼用的作物.苦荞已有两千多年的栽培历史，研究表明，我国不仅是苦荞的地理起源地，也是该物种的散布中心[1].作为一种典型的高寒阴凉气候下生长的作物，我国苦荞通常种植在西南高原山地和西北黄土高原山区，主要涉及四川、云南、贵州等省.苦荞具有较强的适应性和抗逆性，能够适应高海拔地区的低温、强辐射、土地贫瘠等不良环境[2].

研究证实，苦荞中含有大量的黄酮类成分，主要以芦丁为主，其次还包括黄酮醇、查尔酮、槲皮素与山奈酚等，具有降血脂、降血糖、抗氧化与抗癌等多种功效[3-4].Wang等[5]研究表明，苦荞麸皮中黄酮类成分具有良好的DPPH清除率和ORAC值，表明其具有较强的抗氧化能力.除黄酮类外，苦荞中还富含其他活性物质，Hu等[6]利用富含荞麦d-手性肌醇的饲料进行小鼠喂养，研究结果表明，苦荞提取物能够降低小鼠血糖水平，提升小鼠肝脏SOD和GSH-Px活性，从而有望用于治疗高血糖和肝脏氧化应激损伤等.

随着现代分子生物学技术的发展，苦荞在遗传多样性分析、功能基因分析及组学分析方面取得了较大进展.尤其是随着高通量测序技术的快速发展，在苦荞中涌现出了大量的序列信息.截至2018年8月，在美国国家生物信息技术中心数据库中，关于苦荞基因组序列信息已存有概览序列23条，高通量序列1 760个.本课题组也利用Illumina测序平台，完成了苦荞干旱和盐胁迫的转录组测序分析[7].本研究综述了苦荞遗传多样性、基因组和转录组及功能基因等方面的研究进展，并结合当前研究的不足探讨了苦荞分子生物学未来的研究方向，拟为进一步挖掘关键性状关联的标记位点和重要活性物质的分子调控机理等方面的研究提供参考.

1 分子标记和遗传多样性

与性状(表型)鉴别和成分分析相比，基于分子水平的鉴定方法能够排除环境和取材部位等诸多因素的干扰，具有重复性好和稳定性高的优点.目前，苦荞分子标记技术已经应用于苦荞遗传多样性分析、遗传连锁图谱构建和种质资源评价等方面.苦荞分子水平鉴定技术主要分为两类，一类是基于聚合酶链式反应(PCR)的分子标记技术；另一类是DNA序列标记.基于PCR技术的分子标记技术在遗传进化分析中应用较多，在苦荞研究中具有较长的历史.近年来，研究者通过体系优化和引物筛选等方法对苦荞分子标记体系进行优化，建立了更为有效的苦荞分子标记方法[8-9].在DNA序列标记方面，核糖体ITS等序列具有种内保守、种间差异的特点，已经用于荞麦种间和近缘属间的遗传多样性分析[10].

随着测序技术的发展，基于组学的分子标记技术在苦荞中逐渐被建立，通过运用苦荞全基因组和转录组测序数据进行SSR标记开发，为苦荞分子标记提供了一条高效和简便的途径[11-12].

目前，荞麦属约有15种和2个变种，几乎遍及所有栽培粒类作物的地区，我国有10种2变种，主要为苦荞和甜荞栽培种.屈洋等[13]对我国7个省份的83份苦荞种质资源进行SSR标记分析，结果表明，北方产区(陕西、甘肃、宁夏)亲缘关系较近，西南产区(四川、贵州、云南、西藏)亲缘关系较近，此说明我国苦荞群体具有一定的区域性，且两大产区之间存在一定的遗传物质交换，西南苦荞群体多态信息量差异不大，表明这些种质资源可能具有相同的地理起源.黎瑞源等[14]利用EST-SSR技术对我国35个审定苦荞品种进行种质资源遗传多样性分析，涉及“川荞”、“晋荞”、“黔荞”等主要栽培品种，结果表明，苦荞审定品种的各类群体之间没有明显的地域分布趋势，其遗传差异性较小、遗传基础狭窄，但能反映审定品种间的亲缘关系.

遗传连锁图谱不仅是重要功能基因克隆、基因结构分析和关键性状QTL定位的重要手段，也是利用分子育种技术对苦荞优良性状进行定向改良的关键.目前，构建的苦荞遗传连锁图谱标记相对较少、密度低，限制了QTL位点挖掘.遗传图谱将有助于苦荞重要性状的分离和分子标记辅助育种工作的开展，后续应继续扩大作图群体数量，构建高密度和饱和度的遗传图谱，并基于田间数量性状调查和基因功能分析等手段来验证结果的可靠性，可为苦荞种植关键农艺性状的改良提供精准目标.

2 基因组和转录组学

研究发现，苦荞繁殖为严格的自花授粉，从而基因杂合度较低，加之其基因组相对较小，适合全基因组测序.Logacheva等[15]运用Illumina测序技术对苦荞进行全基因组测序，共组装得到了372 Mb的序列，约占苦荞全基因组大小的70%.Zhang等[16]选择苦荞Pinku1材料，采用三代测序和光学图谱等技术，综合Illumina、BioNano、PacBio、Hi-C等测序方法，得到了高质量全基因组数据；最终获得基因组全长为498.3 Mb，Contigs数目为8 778个，其Contig N50为550.7 Mb，共预测得到33 366个基因，GC含量为37.8%；通过光学图谱分析，436.4 Mb序列能够锚定到8条染色体上，定位比例高达89.18%.为了进一步验证测序结果的可靠性，作者还利用GeneBank数据库中的97条mRNA序列对组装序列完整性进行评估，结果表明，其覆盖度占比为99.36%，进一步验证了其基因组组装的高精度.除核基因组外，Liu等[17]也完成了苦荞叶绿体基因组测序工作，苦荞cpDNA全长为159 272 bp，GC含量为37.9%，含有79个蛋白质编码基因、30个tRNA基因和4个rRNA基因，其结论与Cho等[18]的cpDNA测序结果相一致.

基于二代测序技术的转录组测序具有成本低、覆盖度广、效率高等优点，能够快速全面地获得基因表达情况，为基因挖掘提供了一种有效的手段[19].黄酮作为苦荞中重要的活性成分物质，因其具有抗氧化和降脂降糖的功效而成为研究热点.Yao等[20]分别对黑苦荞麦和黄苦荞麦的花进行转录组测序，检测到差异表达基因数目为824个(上调表达191个)，其中苯丙氨酸解氨酶、查尔酮合成酶、查尔酮异构酶和槲皮素3-O-葡糖基转移酶的编码基因具有较高的表达水平，而黄酮醇合成酶的编码基因表达水平较低，这可能是造成苦荞中芦丁含量高而槲皮素含量较低的原因.尽管苦荞耐贫瘠，抵抗干旱、盐、紫外等能力较强，但之前对苦荞耐逆性响应机制却少有报道.Zhu等[21]运用Illumina测序平台对50 μM铝胁迫下0 h和6 h的“西荞2号”根尖(0～2 cm)和基部(2～4 cm)进行转录组分析，结果表明，苦荞细胞壁毒性和氧化应激防御的相关基因被诱导表达，且有机酸代谢并非铝胁迫诱导有机酸分泌的限速步骤.本研究组也通过模拟胁迫的方式对苦荞干旱和盐胁迫转录组进行分析(部分数据未发表)，研究其耐逆性分子机理.如将苦荞进行200 mM NaCl的盐胁迫处理，对其生理生化指标进行分析，并运用Illumina测序方法对盐胁迫和对照的基因表达情况进行对比分析，结果表明，编码蛋白激酶、磷酸酶、热休克蛋白、ATP结合盒转运蛋白、谷胱甘肽S-转移酶等与苦荞盐胁迫响应有关[7].除黄酮物质合成和逆境响应等方面外，Zhang等[16]在苦荞不同组织和不同发育阶段均进行了转录组测序和数据分析工作，为进一步明确苦荞中关键基因的功能及分子改良提供了候选基因.

3 基因片段及相关分析

黄酮类物质是苦荞的主要活性成分，其生物合成代谢途径中关键基因及调控因子是研究的重要内容.目前，在模式植物中，黄酮类物质的合成途径已经研究较为透彻，涉及查尔酮合成酶基因、4-香豆酸:辅酶A连接酶基因以及MYB和WD40等转录因子.苦荞黄酮类物质合成途径的分析也主要围绕上述关键基因和转录因子展开.Yao等[22]根据其他植物已知的WD40基因(拟南芥和玉米)设计简并引物，结合RACE的方法，克隆得到了苦荞FtWD40基因，其cDNA序列全长为1 097 bp，ORF长度为1 035 bp，编码344个氨基酸.qRT-PCR结果表明，FtWD40在苦荞花中表达量最高，与花青素含量相一致；同时，FtWD40在ABA、低温、紫外UV-B等胁迫下表现为上调表达.酵母杂交实验表明，FtWD40具有转录激活活性.将该基因重组到表达载体pCAMBIA1301，并导入烟草中进行异源表达，结果表明，超表达FtWD40的转基因烟草表现为花青素含量增加，花瓣颜色加深；同时，二氢黄酮醇-4-还原酶(DFR)和花色素苷合酶(ANS)基因表达量表现为上调，而黄酮醇合酶(FLS)基因的表达水平降低.Zhang等[23]结合苦荞基因组和转录组数据，对苦荞中受茉莉酸调控的R2R3类型MYB转录因子进行挖掘，运用酵母单杂交、酵母双杂交和Western blot等对其调控芦丁合成的分子机制进行研究.结果表明，FtMYB13、FtMYB14、FtMYB15和FtMYB16均定位于细胞核；在蛋白水平上，FtMYB13、FtMYB14和FtMYB15均受茉莉酸诱导降解，从而直接抑制苦荞芦丁合成途径中的关键酶基因的表达.同时，FtSAD2和FtJAZ1能够显著促进FtMYBs的抑制子活性.Zhou等[24]利用酵母双杂交和双分子荧光互补验证了FtMYB11可与SAD2和FtJAZ1相互作用，其通过与FtSAD2或FtJAZ1相互作用来抑制苯丙烷类生物合成.此外，FtMYB中保守序列SID中的天冬氨酸起到关键作用，其突变能够影响FtMYB11亚细胞定位和与SAD2的相互作用.

此外，在苦荞逆境胁迫响应的关键基因挖掘方面，Zhou等[25]通过克隆得到了一个含有516 bp开放阅读框的FtMYB12基因，其定位于细胞核，具有转录激活活性.荧光定量结果表明，FtMYB12在茎中表达最高；冷胁迫下，其表达量显著增加.FtMYB12转基因拟南芥耐寒性增强，且该过程与COR15a基因表达相关.同时，研究也表明，FtMYB9等苦荞MYB家族基因通过调节不同的应激反应信号传导途径在盐和耐旱性中起积极作用.

4 结 语

作为药食同源的作物，苦荞在品种选育、栽培技术、活性成分以及食品加工等各方面均取得了较大研究进展.在苦荞分子生物学的研究方面，苦荞全基因组数据和多种转录组测序结果丰富了其遗传资源，为进一步推动其分子生物学研究提供了重要数据，为苦荞黄酮类活性成分调控和响应逆境胁迫等关键基因的挖掘提供了参考.目前，关于苦荞分子生物学的研究仍存在诸多问题，例如：对苦荞脱壳、产量和黄酮等关键性状的QTLs位点挖掘，并应用于现有品种改良；如何将现有丰富的苦荞基因组和转录组数据进行深入分析和利用等.针对这些问题，建议未来苦荞分子生物学的研究主要围绕3个方面进行：其一是，针对苦荞优良基因型的品种，构建可行的再生和遗传转化体系，运用其对苦荞功能基因进行深入研究和转基因品种培育，并建立苦荞基因编辑技术CRISPR，将其应用于苦荞研究中；其二是，将苦荞基因组、转录组和代谢组等多组学数据进行整合，建立苦荞综合数据库，基于基因组数据和全基因组关联分析等技术手段，对黄酮类活性成分含量、脱壳、耐逆等优良性状相关的QTLs位点和调控机制进行深入研究；其三是，基于关键基因的挖掘和调控通路的机理解析，运用生物化学方法和田间管理等手段对苦荞关键性状进行调控，从而为苦荞栽培和产品加工等提供理论基础.