呼吸道合胞病毒疫苗研究进展

张乐,刘波,吴军

军事医学研究院 生物工程研究所，北京100071

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）是世界范围内引起婴幼儿病毒性急性下呼吸道疾病（acute lower respiratory tract illness，ALRI）最重要的病原体[1]。每年约有3400万儿童感染RSV，其中约340万须住院治疗，约导致20万人死亡，且99%的死亡发生在发展中国家[2]。针对阿根廷56 560名儿童的研究显示，有1293名儿童患有呼吸道感染，61.6%感染了RSV，其中13%已威胁了生命[3]。在美国，5岁以下儿童门诊患者中也有很大比例系由RSV引起[4]。此外，RSV感染的目标人群还包括老年人及免疫抑制人群。对于免疫功能低下患者，尤其是患有血液系统恶性疾病和接受人体干细胞移植的患者，面临着患严重RSV相关疾病的风险[5]。目前对于RSV的防治主要采用被动免疫，1996年获批的RSV免疫球蛋白（RSV-IVIG，RespiGam）可显著降低高危儿童的住院率[6]，但因其需要静脉注射以及存在血液传播病原体的潜在风险，从2004年开始逐渐退出市场。帕利珠单抗（palivizumab）Synagis（MedImmune公司）是惟一获得美国食品药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）认可的人源化单克隆抗体，然而由于高成本，使得帕利珠单抗的使用目前仅限于高危婴儿的小众群体[7]。帕利珠单抗的突变体Motavizumab（MedImmune-AstraZeneca公司），虽被证明比帕利珠单抗具有更高的病毒中和作用[8]，但由于少数治疗的婴儿出现皮肤过敏反应，未能得到美国FDA的批准[9]。而广谱的抗病毒临床药物利巴韦林因出现不良反应且毒性高，也较少用于RSV感染的治疗。因此，研制安全有效的RSV疫苗十分重要，世界卫生组织也将研制RSV疫苗列为全球疫苗计划的优先发展计划之一[10]。

1 呼吸道合胞病毒的生物学特征

呼吸道合胞病毒属副黏病毒科肺炎病毒属，病毒粒子直径为150～300 nm，是不分节段的单股负链RNA，由编码3种跨膜表面蛋白（F、G和SH）、2种基质蛋白（M和M2）、3种核壳蛋白（N、P和L）及2种非结构蛋白（NS1和NS2）的15 222个核苷酸组成[11]。

基因组由核壳蛋白（N）包裹，通过聚合酶（L）催化RNA的合成并对mRNA进行加帽、加多聚腺苷酸尾。P蛋白是一个与N、L和M2-1蛋白相互作用的同源四聚体，是聚合酶的必要辅助因子，其C端与N蛋白的C端相互作用以打开核糖核蛋白结构，使聚合酶结合到病毒RNA上；此外，P蛋白与新合成的N结合，阻止错误装配[12]。M2-1和M2-2是RNA合成因子，M2-1是转录调节因子，当其缺失时转录会提前终止[13]。非结构蛋白NS1和NS2通过阻断干扰素的诱导和信号传递，抑制宿主的免疫应答[14-15]。SH蛋白形成阳离子通道的五聚体结构并抑制感染的细胞凋亡[16]。RSV感染主要由糖蛋白F和G介导，黏附蛋白（G）与宿主细胞膜黏附，促使病毒吸附于细胞表面[17]，融合蛋白（F）介导病毒包膜与宿主细胞膜融合，使病毒进入细胞，在病毒融合和进入期间，F蛋白从亚稳定的融合前构象（pre-F）转变为稳定的融合后构象（post-F）[18]。F蛋白和G蛋白具有较高的免疫原性，可刺激机体产生血清中和抗体。由于F蛋白在病毒包膜外，具有特异性抗原决定簇；亚型间序列较为保守以及膜融合过程中具有关键作用，可引起膜融合的显著构象变化等[19]，使得F蛋白成为RSV抗病毒药物及疫苗研发的重要靶点。

2 呼吸道合胞病毒的流行病学研究

RSV是一种高度传染性的病毒，在人一生中会重复感染。虽然病毒很容易在非人灵长类动物体内感染，且可能引起严重疾病，但人类是RSV的惟一天然宿主。RSV感染流行主要发生在温带地区的深秋、冬季和早春，以及部分热带地区的雨季[20]，我国北方RSV感染主要发生在春冬季，南方多发生在夏秋季。大多数儿童在出生的第1年就感染了RSV，第2年几乎全部感染。反复感染RSV在生命的最初几年频繁发生。有研究显示，在1岁以内感染的儿童中，47%会在第2年再次感染，再次感染不依赖于抗原差异，下呼吸道感染会在首次及再次感染期间发生，但是在随后的感染中发病的严重程度显著降低，这可能反映了获得性免疫的增加。RSV感染出现严重住院最常见的是6周至6个月龄的婴儿，其中在2～3月龄的婴儿中发病率最高[21]。

3 呼吸道合胞病毒疫苗发展

安全有效的RSV疫苗应能防止高危人群因感染RSV而出现下呼吸道疾病，降低住院率及死亡率。20世纪60年代初研制的RSV-福尔马林灭活 疫 苗（formalin-inactivated RSV vaccine，FIRSV），对2月龄婴儿及7岁儿童肌肉注射并进行观察，结果发现并无保护作用，相反，2名接种的婴儿因感染野毒株型RSV而导致死亡，具体原因尚未完全明确。研究认为，福尔马林处理RSV，改变了病毒上的膜蛋白，诱导了非中和抗体应答反应，该灭活疫苗未能诱导有效的CD8+T细胞，致使RSV不易被清除。同时，由于没有有效的中和抗体和CD8+T细胞，RSV在下呼吸道中持续存在并诱导侵袭性的CD4+T细胞和细胞因子应答，介导的炎症反应导致病情加重，即增强的RSV疾病（enhanced RSV disease，ERD）[22]。RSV复制和持续炎症导致婴儿气道阻塞，造成了一定的发病率和死亡率。FI-RSV疫苗事件及动物模型实验中观察到的疾病增加，提示对于血清反应阴性的婴儿和儿童，RSV疫苗应能诱导保护性的中和抗体及CD8+T细胞，并诱发与野毒株相似的CD4免疫反应，即复制型疫苗适合该类人群；对于高危大龄儿童、老年人可采用非复制型RSV疫苗。

在开发有效的RSV疫苗方面，另一个挑战涉及到免疫原性的问题，婴儿免疫系统不成熟，同时存在母体抗RSV的抗体；老年人免疫力低，降低了对疫苗的反应，因此应针对不同人群研制相应的RSV疫苗，并选择合适的受试人群。目前RSV疫苗的研究主要集中在减毒活疫苗、病毒载体疫苗及亚单位疫苗等方面。

3.1 减毒活疫苗

相对于非复制性疫苗，减毒活疫苗有几个优点，尤其是对于从未接触过RSV的婴儿和低龄儿而言：鼻内接种减毒活疫苗可诱导产生全身和局部免疫，因此可同时对抗上、下呼吸道感染；人体对活疫苗的免疫反应和自然感染十分相似，因此暴露于野毒株后不会发生更严重的疾病[23]；与其他鼻内给药的呼吸道减毒活疫苗一样，鼻内给药的RSV侯选苗在存在母传抗体的低龄儿体内可以复制，这对于RSV减毒活疫苗在低龄婴儿体内取得成功十分关键。

RSV减毒活疫苗的研究策略主要包括构建宿主范围突变体、低温传代（cp）突变体[24]和温度敏感（ts）突变体[25]等疫苗。但这些疫苗要么减毒不够（cp RSV和RSV ts-1）[26]导致传播RSV，引起感染；要么减毒过度（RSV ts-2）[27]导致缺失免疫原性。幸运的是当接种了cp RSV和RSV ts-1的婴幼儿自然感染RSV野毒株时，并没有发现病情加重，在此基础上，研究者利用化学诱变使cp RSV进一步减毒，从而获得一系列针对RSV A亚型的cps减毒活疫苗，其效果正在研究中。

一些鼻内给药的减毒活疫苗在成年人和儿童身上都通过了Ⅰ期临床试验评估，其中一种（cpts248/404）还在1月龄儿童身上进行了评估[28]，这些婴儿使用的cpts248/404疫苗虽已高度减毒，但还是引起一些婴儿鼻塞，以致妨碍了婴儿的饮食和睡眠，该结果提示cpts248/404疫苗对低龄儿而言没有充分减毒，同时评估报告提供了在母传抗体存在时RSV减毒活疫苗在复制和免疫原性、cpts疫苗表型稳定性等方面的重要信息。

研究者通过反向遗传学设计了对RSV基因组的2个主要修饰：缺失M2-2基因，体外研究表明M2-2基因缺失导致病毒RNA复制减少，但同时通过转录增加F和G蛋白的表达，这意味着病毒充分减毒，但可能导致增强中和抗体反应[29]；或缺失NS2基因，已知NS2基因促进上皮细胞脱落，并抑制宿主细胞抗病毒Ⅰ型IFN诱导和应答[30]，因此缺失NS2基因可增强先天性免疫应答。候选疫苗RSV LIDΔM2-2于2016年6月至2017年7月进行了Ⅰ期临床试验，该疫苗作为鼻滴剂递送至6～24个月的RSV血清反应阴性婴儿，成功免疫受试者，但抗体滴度高于理想水平，因此该研究提前终止[28]。在此经验基础上，为了获得比RSV LIDΔM2-2更减毒的突变株，研究者筛选出具有温度敏感性的突变株LIDΔM2-2 1030s，并在6～24个月龄的血清阴性婴儿中进行Ⅰ期安慰剂对照试验。减毒活疫苗研究的另一个策略：缺失NS2基因的候选疫苗ΔNS2/Δ1313/1314L，具有遗传稳定性和中等温度敏感性，目前正在Ⅰ期安慰剂对照试验中进行评估，该试验在12～59个月龄的RSV血清阳性儿童和6～24个月龄的RSV血清阴性婴儿中进行。

3.2 病毒载体疫苗

目前，RSV病毒载体疫苗侯选株多采用腺病毒作为载体，通过腺病毒表达F、N、M2-1或其他编码免疫增强效应的非致病性病毒蛋白[31]，N和M2-1蛋白富含T细胞识别位点，可更好地激发针对RSV的特异性免疫应答[32]。与活病毒相似，载体疫苗能够增加呼吸道黏膜的IgA抗体和细胞免疫反应，同时载体的佐剂性质可提高疫苗的免疫原性[33]。GlaxoSmithKline公司来源于黑猩猩腺病毒载体疫苗ChAd155-RSV（GSK3389245A）和GSK3003891A现已进行多项Ⅱ期临床试验，受试者为18～45岁和/或12～17个月的血清阳性的婴儿。另一种由Janssen公司研发的来源于人腺病毒载体疫苗Ad26.RSV.preF（FA2）也正针对老年人及婴幼儿进行临床试验，该侯选疫苗表达的pre-F蛋白进行了5个氨基酸位点的突变，具有一定的热稳定性[34]，所进行的Ⅱ期临床试验于2017年11月开始，预计2019年3月结束，期望该候选疫苗能够诱导出针对pre-F的高滴度中和抗体。

非复制型的安卡拉病毒（MVA）作为病毒载体在其他传染病的疫苗研究中被广泛使用，并已被证明其安全性[35]，现也应用于RSV疫苗的研究。Bavarian Nordic公司针对老年人的MVA-BN RSV候选疫苗就是采用MVA病毒载体，表达F、G蛋白（A、B亚型）及N、M2蛋白，已进入Ⅱ期临床试验。此侯选苗旨在诱导针对2种RSV亚型的保护性免疫应答，其研究结果表明：与接受安慰剂的受试者相比，在单次加强免疫接种后2周观察到抗体显著增强（2～4倍），包括针对RSV的中和抗体（IgG）及IgA抗体，在单次加强免疫接种后1周，在大多数受试者中观察显著T细胞应答（5～10倍）。同时，2种剂量水平下，疫苗均显示出良好的耐受性和免疫原性。目前正在检测Ⅱ期临床接种后6个月的血液样品，接受任一剂量单次疫苗接种的受试者将在今年晚些时候再次接种加强免疫，以观察疫苗接种后12个月的免疫反应和再次强免疫接种的效果。

3.3 RSV亚单位疫苗

减毒活疫苗及载体疫苗对婴儿最有希望，对于孕妇和老年人，这类人群不像婴儿那样易出现ERD，因此基于RSV蛋白的疫苗可能是最有效的候选疫苗。RSV中和抗体可从母体经胎盘转移到胎儿，从而通过被动免疫对子宫内的胎儿进行免疫。因此，母体免疫可以增加经胎盘转移的抗体水平[36]。此外，实验研究结果显示，妊娠期间RSV感染会改变后代的出生后免疫力和气道高反应性[37]。这些发现进一步阐明了母体免疫在婴儿期预防RSV感染和感染后遗症的重要性。

RSV的F和G蛋白可以诱导中和性抗体及保护性抗体，已作为有希望的候选疫苗进行了评估。GlaxoSmithKline公司的亚单位疫苗RSV F（GSK3003891A）就是针对F蛋白的，其表达的可溶性分泌F蛋白主要是pre-F构象，Ⅰ期临床试验结果显示具有一定的安全性和免疫原性[38]，然而，由于生产期间pre-F抗原的不稳定性，于2017年进行的Ⅱ期临床试验宣布停止。

Novavax公司的RSV F蛋白重组纳米颗粒候选疫苗表达的是带有部分氨基酸突变全长post-F蛋白，该疫苗显示在豚鼠模型中能够提高经胎盘传递的抗体，同时在18～35岁女性中无疫苗相关的不良反应，针对不同人群的疫苗已分别进入Ⅲ期及Ⅰ期临床试验。但2016年9月该公司宣布针对老年人的RSV F蛋白纳米颗粒疫苗Ⅲ期临床试验失败，原因主要是没有达到预先指定的主要和次要疗效指标，没有证明疫苗的有效性。

另一种正在开发的亚单位候选疫苗RSV F DS-Cav1是利用结构生物学的方法对F蛋白进行改造，包括促进三聚体的稳定性、引入半胱氨酸残基以形成二硫键，以及在空腔处填充疏水残基等方式[39]，获得稳定的pre-F构象。该疫苗能够保留病毒表面F蛋白pre-F构象的中和敏感性表位，目前正在进行Ⅰ期临床试验[40]，评估RSV F DSCav1在孕妇及老年人群急性呼吸道患者中的安全性和免疫原性。

RSV中和抗体主要针对F蛋白的pre-F构象，但在生产或溶液储存过程中pre-F构象很可能过早地重新形成稳定的post构象。MEDI-7510是由post构象的F蛋白与吡喃葡萄糖脂质A（一种合成的TLR-4激动剂）佐剂[41]构成的亚单位RSV疫苗，Ⅰ期临床试验研究评估了在60岁或以上人群中的安全性和免疫原性，结果显示，接受MEDI-7510治疗的受试者的免疫反应显著高于安慰剂，疫苗的安全性与安慰剂相似[42]。Ⅱ期试验于2016年11月终止，具体原因未说明。

4 结语

目前大部分RSV疫苗的研究主要针对F蛋白，由于Novavax公司的RSV F纳米颗粒疫苗（post-F构象）Ⅲ期临床试验的失败，使得人们将更多希望放在了pre-F构象的研究上。减毒活疫苗的开发要注意避免疫苗接种后引起的不良反应，以及避免因接种疫苗出现免疫反应不平衡而带来的疾病，这些限制使得疫苗在减毒同时又保持适当的免疫原性非常困难。RSV病毒载体疫苗通过腺病毒、安卡拉病毒、新城疫病毒等病毒载体主要表达F蛋白或G蛋白，具有良好的前景，但大都处于开发的早期。而亚单位疫苗适合已经建立非致病性免疫反应的人群，但这种应答需要多次刺激，包括添加佐剂等，由于具有一定的安全性及免疫原性，亚单位疫苗被认为是最具有发展潜力的RSV候选疫苗。

数十年来，人们对RSV相关疾病带来的社会经济负担有了越来越深的认识，使得更多的关注度落在其疫苗的开发上。尽管RSV疫苗的研究设计存在多重困难，诸如疫苗接种后可能会出现ERD；缺乏相关的免疫机理研究；面对不同目标人群，尚未有一致的临床试验终点等，但结构生物学等新方法和新技术的应用，为尽早阐明RSV的免疫保护机制提供了可能，拓宽了预防RSV感染的前景，前期临床研究结果也为该领域的发展奠定了基础，一批针对不同人群的疫苗候选株已进入临床试验，有望为RSV的防治做出贡献。