脑膜瘤组织中相关分子标志物表达与预后的关系

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脑膜瘤作为一种实体肿瘤，属于脑膜内皮上的细胞肿瘤，其发病率居颅内肿瘤第二位，对患者健康造成严重威胁[1-2]。因此，探究与脑膜瘤发生、发展及预后相关的分子标志物有着重要意义。相关研究表明，上皮细胞激酶(Erythropoietin-producing hepatocellular receptor A2，EphA2)、血管上皮钙黏附素(Vascular endothelial cadherin，VE-cadherin)及骨膜蛋白(Periostin，PN)的表达水平与肿瘤组织分级、肿瘤的局部浸润能力、肿瘤复发及预后等相关[3-5]。EphA2、VE-cadherin、PN的异常表达共同参与肿瘤的发生、发展，但有关EphA2、VE-cadherin及PN在脑膜瘤中表达的相关性及生存预后分析的研究文献报道较少。因此，本研究采用免疫组织化学链霉素抗生素蛋白法(Streptomycin antibiotic protein method，SP)染色法检测EphA2、VE-cadherin、PN在脑膜瘤中的表达情况，并分析EphA2、VE-cadherin、PN表达与脑膜瘤患者临床病理及预后的关系，为脑膜瘤的诊断与治疗提供有效的依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2008年5月至2013年6月在本院经手术治疗的78例脑膜瘤患者作为研究对象，最终纳入68例，其中男性32例，女性36例；年龄范围39～72岁，平均年龄(49.13±8.74)岁；根据2007WHO脑膜瘤分级系统对脑膜瘤组织进行分级，其中Ⅰ级脑膜瘤组织38例，Ⅱ级脑膜瘤组织18例，Ⅲ级脑膜瘤组织12例。择同期进行颅内减压术治疗的21例患者作为健康对照，其中男性9例，女性12例，年龄范围41～70岁，平均年龄(50.25±9.22)岁。纳入标准：术后病理证实为脑膜瘤；所有脑膜瘤患者均为首发。排除标准：合并其他严重疾病；术前接受放化疗。两组患者在性别(x2=0.114，P=0.736)、年龄(t=0.507，P=0.614)方面比较，差异不具统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本次研究所有患者均知情同意，签署知情同意书，并经我院医学伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 主要试剂及仪器 兔抗人EphA2多克隆抗体、兔抗人VE-cadherin多克隆抗体、兔抗人PN多克隆抗体均购自美国Bioworld Technology公司；免疫组化SP法试剂盒、DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；BAC法蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术公司；电泳仪(美国Bio-Rad公司)；Kodak Image Station 2000MM成像系统(美国KODAK公司)。

1.2.2 免疫组化 石蜡包埋脑膜瘤组织，切片，并经二甲苯脱蜡、梯度乙醇进行水化，最后行免疫组化SP法测定脑膜瘤组织中EphA2、VE-cadherin和PN表达。免疫组化SP法步骤如下：①水化后，滴加柠檬酸缓冲液，微波加热进行抗原修复；②用PBS缓冲液洗涤后，置于3%过氧化氢溶液中10min，然后继续用PBS缓冲液洗涤，最后用山羊血清进行封闭；③分别滴加一抗(兔抗人EphA2多克隆抗体、兔抗人VE-cadherin多克隆抗体、兔抗人PN多克隆抗体)，4℃环境下过夜；④次日，室温放置2 h，滴加二抗；⑤DAB显色，苏木精进行复染，脱水、透明后封片观察。

EphA2、VE-cadherin阳性结果判定参考文献[6,7]，若细胞质、细胞核染色为棕褐色，则判定阳性。若无阳性细胞或阳性细胞占比小于10%，判定为“-”；若阳性细胞占比在10%～25%之间，判定为“+”；若阳性细胞占比在26%～50%之间，判定为“++”；若阳性细胞占比大于50%，判定为“+++”。PN阳性判定根据细胞间质条状粗细，采用半定量分析。阴性或弱阳性小于5%，判定为“±”；中度阳性在5%～50%之间，判定为“+”；强阳性大于50%，判定为“++”。

1.2.3 Western blot法 取脑膜瘤组织，滴加蛋白裂解液并研磨，后经超声细胞破碎仪破碎。用BAC法蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取总蛋白上样进行电泳，然后滴加兔抗人EphA2多克隆抗体、兔抗人VE-cadherin多克隆抗体、兔抗人PN多克隆抗体，并于4℃环境下过夜，次日加入化学发光剂进行显影、曝光，并使用Kodak Image Station 2000MM成像系统进行灰度分析。该实验重复3次，取其平均值。

1.2.4 随访 对脑膜瘤患者进行为期5年的电话随访，了解其术后复发情况。

1.3 统计学方法

2 结 果

2.1 EphA2、VE-cadherin、PN在脑膜瘤组织中的表达

EphA2在脑膜瘤组织中阳性表达47例(69.12%)，与正常脑膜皮组织(28.57%)比较，差异有统计学意义(χ2=10.951，P<0.01)。VE-cadherin在脑膜瘤组织中阳性表达50例(73.53%)高于正常脑膜皮组织(33.33%)，差异有统计学意义(χ2=11.258，P<0.01)。PN在脑膜瘤组织中中度阳性和强阳性表达31例(45.59%)也较高于正常脑膜皮组织，差异有统计学意义(χ2=14.690，P<0.01)。详见表1及图1。

2.2 不同级别脑膜瘤组织中EphA2、VE-cadherin、PN表达

随着脑膜瘤组织病理WHO分级的升高，脑膜瘤组织中EphA2、VE-cadherin、PN表达也随之升高，经R×C表相关分析可知，三者与WHO分级均呈正相关(rs=0.649、0.565、0.887，P<0.01)。

表1 EphA2、VE-cadherin、PN的表达

图1 EphA2、VE-cadherin、PN在脑膜瘤组织中的表达(SP法)

表2 EphA2、VE-cadherin、PN在不同级别脑膜瘤中的表达情况(例)

2.3 脑膜瘤组织中EphA2、VE-cadherin、PN表达的相关性

经R×C表相关分析得，脑膜瘤组织中EphA2与VE-cadherin表达呈正相关(rs=0.808，P<0.05)(表3)；EphA2与PN表达呈正相关(rs=0.798，P<0.05)(表4)；VE-cadherin与PN表达呈正相关(rs=0.846，P<0.05)，(见表5)。

表3 脑膜瘤组织中EphA2、VE-cadherin表达的相关性

表4 脑膜瘤组织中EphA2、PN表达的相关性

表5 脑膜瘤组织中VE-cadherin、PN表达的相关性

2.4 脑膜瘤组织中EphA2、VE-cadherin、PN蛋白表达

EphA2、VE-cadherin、PN在正常脑膜皮组织、脑膜瘤Ⅰ级、脑膜瘤Ⅱ级和脑膜瘤Ⅲ级中表达存在差异(P<0.05)，均随脑膜瘤病理级别升高而表达量增加，差异有统计学意义(P<0.05)。PN在正常脑膜皮组织和脑膜瘤Ⅰ级中表达不存在统计学差异(P>0.05)。详见图2及表6。

图2 脑膜瘤组织中EphA2、VE-cadherin、PN表达

表6 EphA2、VE-cadherin、PN在脑膜瘤组织中的表达

2.5 EphA2、VE-cadherin、PN与脑膜瘤患者预后的关系

通过随访脑膜瘤患者术后复发情况得知，68例脑膜瘤患者5年内复发23例，复发率为33.82%。EphA2蛋白表达为“-”、“+”、“++”和“+++”的脑膜瘤患者复发率存在差异(χ2=15.810，P<0.05);VE-cadherin蛋白表达为“-”、“+”、“++”和“+++”的脑膜瘤患者复发率存在差异(χ2=26.114，P<0.05);PN蛋白表达为“±”、“+”和“++”的脑膜瘤患者复发率存在差异(χ2=39.673，P<0.05)。随着脑膜瘤组织中EphA2、VE-cadherin、PN表达量的增加，脑膜瘤患者术后复发率也随之增加。详见表7。

表7 EphA2、VE-cadherin、PN与脑膜瘤患者术后复发的关系

3 讨 论

脑膜瘤作为颅内常见的实体肿瘤，临床首选治疗方案为手术切除，但肿瘤切除后，仍有部分患者再次复发[8]，因此预后较差。研究表明，其生存预后与肿瘤组织血管的重建及某些调节蛋白关系密切，故研究脑膜瘤组织中与血管重构及蛋白降解相关因子的表达可能为改善脑膜瘤患者预后提供可靠依据。因此，研究EphA2、VE-cadherin、PN在脑膜瘤组织中的表达，并探讨其与脑膜瘤患者病理级别及预后的关系，以期为脑膜癌的诊断与治疗提供有效的依据。

EphA2作为细胞外调节蛋白激酶的一员，其水平可由配体EphrinA1所调控，并完成体内后续降解。有关研究表明，EphA2具有多样化生物功能，在人体正常机体组织中表达水平较低，但其在脑胶质瘤、肝癌、喉癌、膀胱癌等肿瘤组织中呈现出高表达[9]。本研究中，EphA2在脑膜瘤组织中阳性表达率较正常组织高。该研究显示EphA2表达程度与脑膜瘤的发生具有一定的相关性，推测原因为在脑膜瘤组织中，细胞间的信号交流能力减弱，使EphA2难以特异性识别并结合EphrinA1，导致其在体内降解受障碍，而呈现为高表达。VE-cadherin作为首个被发现的血管生成拟态(vasculogenic mimicry，VM)重要调控因子，是一种能够维持血管内皮细胞极性和完整性不可或缺的特异性结构蛋白，可作为相同类型细胞间的黏附介质，且与细胞膜的稳定分布和血管内皮细胞粘连功能密切相关[10]。研究表明[11]，阻断VE-cadhefin在胰腺癌和黑色素瘤组织中的表达，可有效遏止VM的形成。本次试验结果显示，较正常组织，VE-cadherin在脑膜瘤组织中呈现阳性高表达，提示VE-cadhefin的高表达对脑膜瘤的发展起着促进作用，但有研究结果显示VE-cadherin在结肠癌组织中阳性表达率较癌旁正常组织中阳性表达率低[12]，原因可能为本次实验为单中心研究，受样本量及地域等因素的影响所致。PN是一种由成骨细胞及其前体分泌产生的多功能细胞外基质蛋白，并与骨形成及组织再生关系密切。研究表明[13]，PN在肿瘤的表达较正常组织有明显差异。本研究结果显示，PN在脑膜瘤组织中中度阳性和强阳性表达率较正常组织高，提示PN能影响脑膜瘤细胞的发展及侵袭，推测原因可能为PN通过上调脑膜瘤细胞分泌VEGF-C，加速脑膜瘤的淋巴血管形成，导致促进其生长、浸润及转移[14]。

Wallesch，等[15]通过转染的VE-cadherin恢复EphA2的磷酸化，发现引入的VE-cadherin重新分布了EphA2的配体，可使EphA2与EphrinA1结合及降解。通过对不同级别脑膜瘤组织中EphA2、VE-cadherin、PN表达研究，发现随着脑膜瘤组织病理WHO分级的升高，脑膜瘤组织中EphA2、VE-cadherin、PN表达也随之升高，且三者均与WHO分级呈正相关，与Wang，等[16]的研究结果一致，提示三者表达与脑膜瘤发生、发展过程存有一定程度的协同作用。本研究通过检测不同级别脑膜瘤组织中EphA2、VE-cadherin、PN蛋白表达量，结果表明，EphA2、VE-cadherin、PN蛋白表达量随脑膜瘤病理级别升高而增加，提示，三者联合检测可作为诊断、预测脑膜瘤分级的指标。另外，本研究也发现，脑膜瘤组织中VE-cadherin表达和EphA2与PN表达均呈正相关，提示VE-cadherin的表达可能通过影响EphA2和PN的功能而改变肿瘤细胞的发展和黏附能力，进而导致肿瘤组织的侵袭和迁徙。PN与EphA2表达呈正相关，提示PND的表达通过调控EphA2的表达，诱导多种信号通路和途径参与和促进肿瘤的发生发展。上述结果表明，EphA2、VE-cadherin、PN均与脑膜瘤分级有密切相关，提示临床上应对不同级别脑膜瘤患者制定针对性治疗方案。本研究还对脑膜癌患者5年生存率的研究发现，随着脑膜瘤组织中EphA2、VE-cadherin、PN表达量的增加，脑膜瘤患者术后复发率也随之增加。结果提示，EphA2、VE-cadherin、PN共同参与了脑膜瘤的发生、发展，且与脑膜瘤患者预后存在关联。本研究采用单中心分析，实验结果在一定程度上存在偏倚，加大样本量，进行多中心研究实属必要。

综上所述，EphA2、VE-cadherin与PN均与脑膜瘤的发生、发展有关，且三者均可作为评估脑膜瘤患者生存预后的指标。