小反刍兽疫病毒四川简阳株N基因的系统进化分析

张毅，张东，陈斌，蔡冬冬，裴超信，李春

（四川省动物疫病预防控制中心，四川 成都 610041）

本研究对四川省动物疫病预防控制中心保存的2014年简阳小反刍兽疫病毒（PPRV）阳性鼻拭子进行了PPRV系统进化分析，旨在对四川省2014年发生的PPR疫情进行数据补充。

1 材料

1.1 主要试剂 病毒RNA提取试剂盒，购自北京世纪元亨动物防疫技术有限公司；PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2（Dye Plus）试剂盒，购自大连宝生物工程有限公司。

1.2 PPRV阳性材料 2014年从四川简阳地区采集羊鼻拭子1份，经荧光RT-PCR确定为PPRV阳性，由四川省动物疫病预防控制中心实验室于-80℃保存。

1.3 引物 参照文献[1]合成引物，用于N基因扩增。目的片段预期长度为1845bp，扩增引物NF：5'-ACCAAACAAAGTTGGGTAAGGA-3'，N-R：5'-CAGCCCCTTGTTGACATGGTAT-3'。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

2 方法

2.1 PPRV SCJY株N基因的扩增和序列测定

2.1.1 核酸提取 将鼻拭子以9 100 r/min离心2min，取上清液，按照病毒RNA提取试剂盒说明书提取病毒RNA，-20℃保存待用。

2.1.2 RT-PCR扩增和序列测定 取5 μL病毒RNA，按RT-PCR试剂盒说明书配制50 μL反应体系，按以下程序进行扩增：50℃ 30min，94℃ 5 min；94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 90s，循环 35 次；72℃延伸5min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳确认后，送生工生物工程（上海）有限公司克隆、测序。

2.2 PPRV基因组序列分析 从GenBank获取PPRV代表毒株N基因序列15条，通过DNASTAR软件，采用Clustal W方法进行N基因核苷酸比对和氨基酸比对；通过MEGA6软件，采用Neighbor-Joining法构建N基因进化树，Bootstrap值为1000。

3 结果

3.1 PPRV SCJY株N基因的扩增及测序结果 PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果显示：扩增出约1.8kb条带，与目的片段大小相同（图1）。扩增产物克隆测序成功，序列全长1845bp。

3.2 PPRV SCJY株N基因的同源性分析结果 将SCJY株与15条参考序列进行比对分析，参考序列信息见表1。16株PPRV N基因的长度均为1578nt。同源性分析结果（图2）表明，16个PPRV毒株N基因的核苷酸同源性介于88.8%～100%之间，其中SCJY株与新疆株XJYL2013的同源性最高（100%），与乌干达株Uganda 2012的同源性最低（88.9%），与疫苗株Nigeria75/1的同源性为93.6%；N蛋白氨基酸比对结果（图3）表明，16个PPRV毒株N蛋白的同源性介于92.8%～100%之间，其中SCJY株与新疆株XJYL2013、河南株CH/HNNY/2014的同源性最高（100%），与乌干达株Uganda 2012、阿联酋株UAE 1986的同源性最低（92.8%），与疫苗株Nigeria75/1的同源性为94.9%。

图1 SCJY株N基因扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果

表1 SCJY株及参考毒株的信息表

3.3 PPRV SCJY株N基因的系统进化分析结果 SCJY株与参考株的N基因核苷酸Neighbor-Joining进化树见图4。如图所示，16株PPRV的N基因形成了Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4个谱系：塞内加尔E32株构成Ⅰ系，尼日利亚疫苗株Nigeria/75/1和加纳株Ghana/NK1/2010构成Ⅱ系；阿联酋株UAE 1986、埃塞俄比亚株Ethiopia 1994、苏丹株MIELIK_72、乌干达株Uganda 2012构成Ⅲ系；SCJY株和其他4个中国株（河南、新疆、北京、西藏）的遗传距离最近，这5个中国株与土耳其株、摩洛哥株、2个印度株构成Ⅳ系。

图2 16株PPRV N基因的核苷酸同源率

图3 16株PPRV N蛋白的氨基酸同源率

图4 16株PPRV N基因系统进化树

4 讨论

根据N基因序列，世界范围内的PPRV毒株可以分为4个谱系[1]，各型具有明显的地域特征，Ⅰ系主要是西非（科特迪瓦、塞内加尔和几内亚）毒株，Ⅱ系主要是加纳、尼日利亚和马里毒株，Ⅲ系主要是东非（埃塞俄比亚和苏丹）和阿拉伯半岛南部（阿曼和阿联酋）毒株，Ⅳ系主要是亚洲毒株，包括中国、土耳其、以色列、沙特阿拉伯和印度等，本研究的分型结果与文献报道类似。本研究中的SCJY株属于Ⅳ系，其N基因与新疆株的同源性达到100%，与同时期国内流行毒株的同源性也在99%以上，表明SCJY株与2013～2014年我国发生的PPRV主要毒株相同，该毒株进入国境后迅速传播到不同地区，尚未在各地区开始基因组演化。

目前，尼日利亚株Nigeria/75/1是OIE唯一允许使用的疫苗株，临床免疫保护效果好[2-3]，免疫保护期长，能满足现阶段预防PPR的需求。然而，Nigeria/75/1是弱毒疫苗，在进化关系上又与我国流行株分属不同的基因型，在疫苗免疫压力下，本地毒株会不会发生突变、重组等演化，从而导致新毒株产生，进而引起免疫失败？是特别需要关注的问题。因此，临床上除对疫苗免疫抗体实施定期监测[4-5]外，还需加强对PPRV病原的监测力度，进一步开展病毒携带率、发病病例的分子生物学分析等研究。