病原检测方法的应用比较

李桂黎，岳建国，李敏，周潇潇，李俐睿，肖金鹏，向晓雪

（四川省成都市动物疫病预防控制中心，四川 成都 610041）

荧光定量PCR（FQ-PCR）方法是20世纪90年代中期发展起来的一种核酸定量检测技术[1]。FQ-PCR在动物疫病检测过程中的发展非常迅速，因特异性高、操作简便、污染少、耗时短等特点而得到广泛应用[2]。本文对FQ-PCR法与其他三种常见病原检测方法的优缺点进行了比较分析。

1 FQ-PCR与普通PCR的比较

1.1 材料

1.1.1 样品 4份传染性皮下及造血组织坏死病毒（IHHNV）的组织匀浆样品及阳性对照样品，均由中国水产科学研究院黄海水产研究所提供。

1.1.2 主要试剂 DNA提取试剂盒、2×Taq PCR MasterMix、ddH2O、DNA Marker（DL2000），均购自天根公司；虾类传染性皮下及造血组织坏死病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒，购自金瑞鸿捷（厦门）生物科技公司。

1.1.3 主要仪器 PCR仪（ABI 2720），电泳仪（DYY-8C），一体化凝胶成像仪（SmartGel），荧光定量PCR仪（杭州博日LineGene9660）。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 各取100μL样品和阳性对照品，以100 μL ddH2O为阴性对照，按照DNA提取试剂盒所述方法提取样品和对照品的DNA，于-20℃保存备用。

1.2.2 普通PCR检测 根据国标（GB/T 25878-2010）对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒检测PCR法[3]，建立PCR反应体系，引物序列（F：5'-CGG-AAC-ACA-ACC-CGA-CTT-TA-3'；R：5'-GGC-CAA-GAC-CAA-AAT-ACG-AA-3'）由成都擎科生物技术有限公司合成。每个反应体系为 50μL，包括：2×Mix 25μL，引物 F 2μL，引物 R 2μL，DNA 模板 2 μL，ddH2O 19 μL。反应程序：95 ℃ 5min；95℃ 30 s，55℃ 30s，72℃ 1 min，35个循环；72℃延伸7min。反应完成后，将PCR产物进行电泳，在一体化凝胶成像仪下观察结果。

1.2.3 FQ-PCR检测 根据荧光定量PCR反应试剂盒使用说明配制反应体系。取2μL的核酸样品、阳性对照品加入已添加了反应试剂的反应管内。将配好的反应体系放入荧光定量PCR仪上，反应程序：42℃ 30min；93℃ 15s，60℃ 1min，共40个循环，同时收集荧光。反应完成后直接读取结果。

1.3 检测结果

1.3.1 普通PCR检测结果 如图1显示，对照成立。2号、3号样品均有目的条带出现，与阳性对照品的条带一致；1号、4号样品无目的条带出现。

图1 PCR反应结果

图2 荧光定量PCR检测结果

1.3.2 FQ-PCR检测结果 本次只进行了定性实验，结果如图2所示。2号样品出现了标准S曲线，其Ct值为21.38；3号样品也出现了标准S曲线，Ct值为20.95；1号、4号样品均未出现曲线。1.4 结果分析 普通PCR方法与FQ-PCR检测方法均能对样品进行检测，检测结果较为可靠，两者的符合率为100%。相较于普通PCR法，FQPCR法的检测步骤少，检测时间短。因此，FQPCR法在动物疫病检测中拥有更多的优势。

2 FQ-PCR与ELISA的比较

2.1 材料

2.1.1 样品 52份犬唾液拭子样品，从成都市青羊区采集得到。

2.1.2 主要试剂 狂犬病病毒实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒，购自哈尔滨世纪元亨生物技术有限公司；狂犬病抗原ELISA检测试剂盒，购自Cedi Diagnostics公司。

2.1.3 主要仪器 荧光定量PCR仪（杭州博日LineGene9660），全波长酶标仪（赛默飞）。

2.2 方法

2.2.1 ELISA检测 根据狂犬病抗原ELISA试剂盒的操作步骤，以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。

2.2.2 FQ-PCR检测 取100μL样品，利用狂犬病病毒实时荧光定量RT-PCR检测试剂盒提取样品及阴性、阳性对照的RNA，将提取的RNA置于-20℃保存备用。按照该试剂盒说明配制20μL反应体系进行荧光RT-PCR反应，体系包括：无菌无核酸酶水 5.2 μL，RT-PCR 反应液 10 μL，酶混合液0.4μL，荧光探针1.4μL，模板RNA 3μL。反应程序：45 ℃ 15 min，95℃ 1min；95℃ 5s，60℃35s，共40个循环，同时收集荧光。反应完成后直接读取结果。

2.3 检测结果

2.3.1 ELISA检测结果 根据ELISA 450 nm波长的检测结果，有5份样品显示为阳性，阳性率为9.6%，但是阳性样品的吸光值均在临界值附近，提示检测出的阳性样品可能为假阳性。

2.3.2 FQ-PCR检测结果 如图3所示，将52份犬狂犬病病毒RNA进行实时荧光定量RT-PCR检测，结果显示：阳性对照出现标准S曲线，阴性对照及样品均无S曲线出现。

2.4 结果分析 本次实验中两种方法的符合率为90.4%。在应用方面，ELISA检测方法常用作抗体检测，实时荧光定量PCR检测方法常用作病原检测。

图3 荧光定量PCR检测结果

图4 荧光定量PCR检测结果

3 FQ-PCR与快速检测卡的比较

3.1 材料

3.1.1 样品 鸡泄殖腔或咽喉拭子50份，源于成都市双流区2017年度秋季重大动物疫病防疫监测抽样。

3.1.2 主要试剂 禽流感通用型荧光定量PCR试剂盒，购自北京世纪元亨生物技术有限公司；禽流感快速检测卡，购自深圳市康佰得生物科技有限公司。

3.1.3 主要仪器 荧光定量PCR仪（杭州博日LineGene9660）。

3.2 方法

3.2.1 快速检测卡检测 将快速检测卡平衡至室温后，按照说明书步骤对样品进行检测，室温放置10～15min后判读结果。

3.2.2 FQ-PCR检测 各取100μL样品、阴性对照品和阳性对照品于1.5mL灭菌离心管中，按照试剂盒中病毒RNA的提取步骤提取模板RNA，于-20℃保存备用。根据试剂盒说明配制20μL反应体系：无菌无核酸酶水2.7μL，RT-PCR反应液10μL，酶混合液 0.4 μL，荧光探针 1.9 μL，样品 5 μL。配好体系后，在荧光PCR仪上进行以下反应：45℃ 15min；95℃ 5s，60℃ 35s，共 40 个循环，同时收集荧光。反应完成后直接读取结果。

3.3 结果

3.3.1 快速检测卡检测结果 根据禽流感病毒通用型抗原快速检测卡产品说明书，检测T线区及对照C区同时出现红色线即判为阳性样品，只有对照C区出现一条红线为阴性样品。本次共检测样品50份，结果有6份为疑似阳性样品。

3.3.2 FQ-PCR检测结果 如图4所示，阳性对照有标准S曲线出现，阴性对照及样品均无S曲线出现。

3.4 结果分析 本次实验中两种方法的符合率为88.0%。快速检测卡灵敏度较高，但特异性较差，检测结果容易出现假阳性，适合大批量样品的初筛。FQ-PCR检测方法则适用于对快速检测出的疑似阳性样品进行复核。

4 小结与展望

荧光定量PCR技术可用于多种病原微生物的检测[4]，具有广阔的应用前景。笔者通过将FQPCR与其他三种常用的疫病诊断方法进行比较，发现FQ-PCR法在动物疫病病原检测中具有独特的优势：灵敏度高、特异性好、操作简单，且用时较短、无毒无污染，适用于像动物疫病预防控制中心这样的动物病原微生物实验室的日常检测工作。面对日益复杂的动物疫病防控形势，选择一种快速准确的疫病诊断方法非常重要。目前常见的动物疫病如猪瘟、口蹄疫等都已经有了荧光定量PCR检测方法的国家标准，市面上也有了成熟的荧光定量PCR检测试剂盒。相信在不久的将来，荧光定量PCR检测方法会更多地应用于动物疫病诊断，为有效防控动物疫病带来更多的便利。