NLRP6炎症小体在肠道中的功能

魏 薇，牛冰玉，姚树坤

(1.中国医学科学院 北京协和医学院，北京100032； 2.北京中医药大学，北京100029； 3.中日友好医院消化内科，北京 100029)

人体依靠固有免疫和适应性免疫抵御病原体入侵，炎症小体的活化及下游炎症因子的分泌对固有免疫具有重要意义，并可将固有免疫与适应性免疫联系起来[1]。核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein，NLRP)6是核苷酸结合寡聚化结构域样受体(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptors，NLRs)家族亚类NLRP之一，NLRs是一类模式识别受体。目前，较明确的NLRs功能包括以下3方面：①其中一组NLRs是炎症小体的重要组成部分，可以调节胱天蛋白酶(caspase)1的活化和促炎细胞因子白细胞介素(interleukin，IL)1β、IL-18的转录；②NLRs可参与常见细胞内信号通路的负调控(如核因子κB和丝裂原活化蛋白激酶通路)，从而影响下游细胞因子和趋化因子的表达；③NLRs还可参与抗病毒免疫的调节[2]。以上3种功能均有NLRP6的参与，NLRP6在肠道黏膜宿主-菌群的相互作用中具有关键调节作用。现主要结合近年来NLRP6炎症小体调控肠道菌群、改善肠屏障功能的相关研究，对肠道中NLRP6炎症小体的功能予以综述。

1 NLRP6炎症小体结构及NLRP6表达部位

NLRP6蛋白编码基因位于人第11号染色体，N端为热蛋白结构域(pyrin domain，PYD)，中间为核苷酸偶联结构域(NACHT/NOD)，C端为富含亮氨酸的重复序列。NLRP6可与caspase-1和含CARD结构域的凋亡相关颗粒样蛋白(apoptosis associated speck-like protein containing CARD，ASC)通过PYD-PYD连接作用组成细胞内多聚蛋白复合物，称为NLRP6炎症小体，N端的PYD为NLRP6炎症小体组装的核心结构，其中的细丝状结构可募集ASC的PYD[3]。NLRP6可在小鼠各器官表达，如膀胱、肾脏、肝脏、肺、十二指肠、回肠、盲肠和结肠等，其中在结肠肌成纤维细胞表达最高，其次为结肠上皮细胞、肝细胞、CD4+T细胞、树突状细胞、CD8+T细胞、肥大细胞，此外，在外周巨噬细胞亦有少量表达[4-5]。而人体NLRP6主要在小肠表达[6]。

2 NLRP6炎症小体在肠道中的功能

2.1NLPR6炎症小体与肠道菌群的相互作用

2.1.1肠道菌群对NLRP6炎症小体的激活作用 NLRP6炎症小体的活化受肠道菌群调节，肠道菌群提供两种激活信号：第一种为Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)配体，促进炎症小体成分和IL-18的转录；第二种包括一些微生物代谢物，如胆汁酸、氨基酸、组胺等；共生原生动物也可调节上皮细胞对IL-18的分泌，但目前机制尚不明确[2]。对围生期大鼠和小鼠的研究显示，微生物在肠道定植后，NLRP6炎症小体成分及其下游炎症因子 IL-18 表达上调，可见微生物可促进NLRP6炎症小体成分的转录及组装[7-8]。

肠道菌群代谢产物方面，牛磺酸、碳水化合物和长链脂肪酸在野生型(wild type，WT)小鼠中较Asc-/-小鼠多，提示牛磺酸、碳水化合物和长链脂肪酸可能是NLRP6炎症小体的激活剂，其中牛磺酸诱导IL-18的作用最强；相反，组胺和精胺在WT小鼠中较Asc-/-小鼠少，并导致肠道IL-18减少，提示组胺和精胺可能对NLRP6炎症小体有抑制作用[8]。炎症小体的活化导致caspase-1依赖的促炎细胞因子(IL-18)的分泌，可能以内分泌的方式触发细胞因子相应受体，并促进抗原提呈、共刺激分子上调及细胞因子释放，最终刺激抗原特异T细胞和B细胞[9]。除微生物相关机制外，NLRP6炎症小体成分的负转录调节还与促肾上腺皮质激素释放激素有关。有研究发现，避水应激建立动物模型的血清促肾上腺皮质激素释放激素升高，小肠和结肠NLRP6表达降低，并出现肠道菌群改变以及肠道屏障功能降低[2,10-11]。

2.1.2NLRP6炎症小体对肠道菌群的调节作用 目前，支持NLRP6炎症小体对肠道菌群具有调节作用的动物实验证据较多。Elinav等[4]研究显示，NLRP6炎症小体缺陷小鼠(Nlrp6-/-小鼠、Asc-/-小鼠、caspase-1-/-小鼠)粪便菌群中普氏菌属和TM7菌属增加，乳杆菌和厚壁菌门减少；与WT小鼠相比，NLRP6炎症小体缺陷小鼠表现出更严重的右旋糖酐硫酸钠(dextran sodium sulfate，DSS)诱导结肠炎、肠道IL-18水平下降；此外，与单独饲养WT小鼠相比，与NLRP6炎症小体缺陷小鼠共饲养的WT小鼠表现出更严重的DSS结肠炎，而共饲养后WT小鼠的粪便菌群与NLRP6炎症小体缺陷小鼠类似，故推测WT小鼠DSS结肠炎的加重可能与肠道菌群的转变相关，且NLRP6对肠道菌群的影响由IL-18介导，菌群失调导致CC类趋化因子配体5表达上调，募集更多免疫细胞，从而导致自发性肠道炎症。此外，与WT小鼠相比，Nlrp6-/-和Asc-/-小鼠的炎症相关结直肠癌更严重，菌群失调导致的 CC类趋化因子配体5增加亦有参与，可激活IL-6旁路，从而促进上皮细胞增殖[12]；与单独饲养WT小鼠相比，与Nlrp6-/-和Asc-/-小鼠共饲养WT小鼠的胆碱缺乏饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎更严重，肝脏中多种炎症细胞显著增加[13]。另有研究显示，共饲养并不能使其他小鼠肠道菌群与Nlrp6-/-小鼠相近，但Nlrp6-/-小鼠存在菌群失调，嗜黏蛋白阿克曼氏菌增加尤其明显，菌群失调是DSS结肠炎加重的基础[14]。由此可见，NLRP6炎症小体对肠道菌群的组成有重要影响，具有减轻肠道炎症的作用。

但有研究发现，Nlrp6-/-小鼠对单核李斯特菌、鼠伤寒沙门菌、大肠埃希菌的易感性减弱，感染上述菌群的Nlrp6-/-小鼠外周血中性粒细胞及单核细胞数量增加，核因子κB和丝裂原活化蛋白激酶依赖的炎症因子和趋化因子水平更高[15]。最近的研究亦显示，Nlrp6-/-小鼠对单核李斯特菌的易感性减弱，单核李斯特菌产生的脂磷壁酸(由革兰阳性细菌产生)可结合NLRP6的C端富含亮氨酸的重复序列，并激活NLRP6；当WT小鼠感染单核李斯特菌时，NLRP6与caspase-1、caspase-11形成复合物，促进巨噬细胞分泌IL-1β、IL-18；注射IL-18的Nlrp6-/-小鼠对单核李斯特菌的易感性增加，因此推测单核李斯特菌感染加重与巨噬细胞分泌IL-18有关，表明NLRP6炎症小体可能对某些细菌感染有不利影响[16]。

近年来，通过对实验研究条件更严格的限定进一步加深了对NLRP6炎症小体调节肠道菌群作用的认识。Lemire等[17]研究发现，同窝出生WT小鼠与Nlrp6-/-小鼠(来源于Nlrp6+/-小鼠)的肠道菌群无明显差异，且经DSS处理后的结肠长度、结肠组织病理学、IL-18分泌情况亦无显著差异，仅表现为雌性Nlrp6-/-小鼠体重下降更快，故认为NLRP6 炎症小体并不能调节肠道菌群，但这一结论对问题进行了过度的简化，这种情况下还应想到是否可能在环境中存在促发菌群失调的病原菌[18]。Galvez等[19]研究发现，遗传和环境因素对菌群的影响超过基因表型的影响，且NLRP6对菌群组成的影响主要发生在病原菌入侵后，当机体处于稳态且在无特定病原体环境中饲养时，WT小鼠和Nlrp6-/-小鼠菌群无明显差异。据此推测，在黏膜破损等疾病状态下(如炎症性肠病)，肠道菌群的改变可能导致NLRP6炎症小体活化，进而调节菌群结构，但无疾病状态下的NLRP6炎症小体并不干预菌群结构。

2.2NLPR6炎症小体与肠道病毒的相互作用Nlrp6-/-小鼠对肠道RNA病毒亦存在易感性，如脑心肌炎病毒和小鼠诺如病毒。NLRP6通过非炎症依赖机制发挥抗RNA病毒作用，肠道上皮细胞的NLRP6 通过与RNA解旋酶Dhx15形成复合体结合病毒RNA，并激发线粒体抗病毒信号蛋白依赖的抗病毒途径，促进 Ⅰ 型干扰素的表达，进而产生抗病毒作用[20]。

2.3NLRP6炎症小体对肠道屏障的影响 肠屏障对维持宿主内环境稳态具有重要作用，肠道黏液、免疫球蛋白A、抗菌肽(antimicrobial peptides，AMPs)、免疫细胞等均参与肠道菌群与宿主免疫系统的相互作用[21]。屏障功能受损可能导致细菌脂多糖入血，出现代谢性内毒素血症，导致机体处于低度炎症状态，并可出现代谢综合征，如肥胖、心血管疾病、胰岛素抵抗[22-23]。

肠屏障可分为化学屏障和物理屏障，前者包括AMPs，后者包括黏液层、单层肠上皮细胞和细胞间的紧密连接。肠道黏液层是抵御病原体入侵、保护上皮免受物理刺激的第一道屏障，其中发挥关键生理作用的成分为黏蛋白；结肠黏液层包括外层黏液层(结构松散，其中包含菌群)以及内层黏液层(紧附于上皮层，密布黏蛋白，可抵御细菌)；小肠黏液层缺乏明确的内外层分界[24]。肠上皮的杯状细胞可产生黏蛋白颗粒并分泌入肠腔形成黏液层。NLRP6炎症小体可通过影响肠道黏液层、肠道AMPs、结肠黏膜修复来影响肠屏障功能。

2.3.1NLRP6炎症小体对肠道黏液层的影响 NLRP6炎症小体可能影响肠道黏液层的形成。 Wlodarska等[25]的研究显示，杯状细胞中存在NLRP6 表达，且Nlrp6-/-小鼠存在黏液颗粒释放障碍，提示NLRP6可能参与黏液屏障的形成；Nlrp6-/-、Asc-/-或caspase-1-/-小鼠肠道未形成厚实连续的内黏液层，而IL-18-/-小鼠肠道黏液层正常形成，表明黏液分泌需要NLRP6炎症小体的介导，但不依赖NLRP6炎症小体下游的炎症因子IL-18。此外，Wlodarska等[25]的研究发现，NLRP6缺乏可影响杯状细胞中自噬体的形成。既往研究显示，自噬对于潘氏细胞、破骨细胞和肥大细胞的分泌功能至关重要，故认为 NLPR6 可通过影响杯状细胞自噬而影响黏液分泌[26-28]。Birchenough等[29]的研究识别了一种位于结肠隐窝入口处的“哨兵”杯状细胞，这种细胞可通过激活TLR-髓样分化因子88依赖的Nox/Duox活性氧合成下游的NLRP6炎症小体，非特异性地吞噬TLR2/1、TLR4及TLR5配体并与之反应，激发钙离子依赖的MUC2分泌途径，并形成细胞间信号，促使隐窝上部邻近杯状细胞分泌MUC2抵御细菌，且不依赖IL-18。与NLRP6炎症小体对菌群的调节类似，“哨兵”杯状细胞依赖NLRP6炎症小体调节黏液层的途径只在细菌入侵机体时发挥作用。

2.3.2NLRP6炎症小体对肠道AMPs的影响 NLRP6炎症小体对AMPs的分泌亦有调节作用。AMPs主要由潘氏细胞和肠上皮细胞产生，包括 α防御素、β防御素、C型凝集素等，不同抗菌肽可针对不同菌群产生抗菌活性，对肠道菌群具有调节作用[30]。AMPs中内凝集素1、抵抗素样分子β、血管生成素4的分泌受IL-18诱导，在无菌小鼠中基本无内凝集素1、抵抗素样分子β、血管生成素4表达，Nlrp6-/-小鼠和Asc-/-小鼠的内凝集素1、抵抗素样分子β、血管生成素4表达降低，提示这些抗菌肽的产生依赖于肠道菌群刺激NLPR6炎症小体产生的IL-18[8]。

2.3.3NLRP6炎症小体对结肠黏膜修复的影响 DSS诱导小鼠结肠炎建模过程中结肠NLRP6表达显著降低，停用DSS后NLRP6表达逐渐增加，且结肠黏膜活检后Nlrp6-/-小鼠的局部损伤修复速度较WT小鼠明显减慢，表明NLRP6可促进黏膜修复[5]。NLRP6炎症小体对黏膜修复的促进可能与IL-18相关；IL-22在结肠上皮细胞的修复过程中有重要作用，IL-22结合蛋白可使IL-22失效，而 NLRP6 炎症小体可通过IL-18依赖的途径下调IL-22 结合蛋白水平[31]。此外，NLRP6对DSS相关结肠炎的保护作用还与Ly6Chi炎症单核细胞相关，DSS诱导结肠炎存在Ly6Chi炎症单核细胞浸润，其中NLRP6表达上调，将WT小鼠的Ly6Chi炎症单核细胞转移给Nlrp6-/-小鼠，后者肠屏障功能显著好转、肠道损伤显著减轻[32]。另有研究发现，Nlrp6-/-小鼠结肠损伤部位周围的上皮细胞增殖更明显，与细胞增殖有关的分子酪蛋白激酶1ε和SMARCC1(SWI/SNF家族成员)的转录水平亦提高，提示缺乏NLRP6可能导致结肠黏膜损伤后的病理性增殖，并与结肠炎相关结肠癌的发生有关[5]。

2.4NLRP6炎症小体在肠道疾病中的作用 肠道中NLRP6炎症小体的重要作用已引起研究者的广泛关注。现已发现，某些肠道疾病中存在肠道NLRP6 的异常表达，如先天性巨结肠患者结肠NLRP6 表达显著下降[33]；炎症肠病患者结肠 NLRP6 表达随病情活动度的增加而升高[34]；Chen等[35]发现，NLRP6缺陷小鼠对结肠炎相关癌变的易感性增强，这与血清和结肠IL-18水平下降有关；Zhao等[36]发现，肠易激综合征模型小鼠结肠NLRP6的表达低于正常小鼠，丁酸梭菌通过对NLRP6 的作用抑制结肠黏膜低度炎，可能对肠易激综合征的内脏超敏反应发挥有益作用。

目前与NLRP6相关的绝大多数研究为动物实验，相关人体的研究较少，某些动物实验结论可能与人体并不符合，因此应谨慎看待动物实验发现的一些机制和结论。如动物实验显示NLRP6与结直肠癌相关，但结直肠癌患者肿瘤组织和癌旁2 cm以上正常结肠黏膜的NLRP6 RNA转录水平差异无统计学意义[37]。NLRP6炎症小体对肠道菌群及肠道屏障均有调节作用，故需进一步探究其在肠道炎症性疾病、肠道肿瘤、肝胆系疾病、代谢综合征等疾病中的作用。此外，NLRP6炎症小体的活化亦与促肾上腺皮质激素释放激素相关，而下丘脑-垂体-肾上腺轴在脑-肠互动中有重要作用，因此NLRP6炎症小体与应激相关疾病(如肠易激综合征)的关系也需要进一步的研究。

3 结 语

NLRP6炎症小体与肠道微生物间存在相互作用，肠道菌群、病毒对NLRP6炎症小体有激活作用。当病原菌侵入肠屏障时，NLRP6炎症小体可发挥调节肠道菌群的作用，NLRP6炎症小体亦可结合病毒RNA、促进干扰素基因表达；此外，NLRP6 炎症小体还可促进肠道黏液的分泌，部分抗菌肽的产生也依赖于NLRP6炎症小体。肠黏膜损伤后，NLRP6炎症小体可促进黏膜修复，同时抑制修复过程中的病理性增殖。动物实验是疾病机制探究的重要工具，目前DSS诱导结肠炎模型在NLRP6炎症小体相关研究中的应用较多，今后可考虑应用其他疾病动物模型进行相对广泛的动物实验。目前，关于NLRP6炎症小体对肠道菌群调节的研究结论并不完全一致，肠道菌群与遗传、性别、年龄、饮食、环境、应激等多种因素密切相关，故应注意控制研究中的干扰因素，以得到更为可靠的结论。