微RNA与缺血性脑卒中的研究进展

周 莹，孟繁兴，刘雪梅，张允岭，王凤丽※

(1.北京中医药大学东方医院 a.脑病一科，b.实验中心，北京 100078；2.中国中医科学院西苑医院脑病科，北京 100091)

缺血性脑卒中是由短暂或永久性的局部脑血流减少引起的一种主要脑血管病，其特征是动脉阻塞，故又称脑梗死，占全球卒中的50%～85%[1]。世界卫生组织称，全球范围内受卒中影响的人数超过1 500万，直接导致约570万(16.6%)人死亡，造成约500万患者终身残疾，并有约430万患者因残疾死亡[2]。目前，在狭窄的时间窗内(发病3～4.5 h)溶栓(重组组织型纤溶酶原激活剂)治疗是治疗缺血性脑卒中的唯一急性措施，因此及时恢复或改善局部脑血供对于改善脑卒中预后和脑卒中后功能恢复至关重要[3]，但受严格的时间窗限制，仅有3.4%～5.2%的患者获得救治[4]，超出溶栓时间窗，提高脑梗死的临床诊疗水平一直是医学界关注的重点。脑缺血过程通常伴随微RNA(microRNA，miRNA)表达谱异常，miRNA通过降解靶mRNA参与神经系统的发生、发育、病理损伤和修复过程[5]。miRNA几乎参与所有的生物学过程，与多种疾病的发生发展关系密切。现就近年来miRNA与缺血性脑卒中的关系进行综述，为缺血性脑卒中的诊断、治疗及预后提供新策略。

1 miRNA的生物合成及作用机制

miRNA是一类长19～22个核苷酸的小型非编码RNA，与信使RNA的3′端非翻译区结合，介导转录后基因调控[6]。miRNA的合成和成熟分为两个阶段，即形成初级miRNA和前体miRNA[7]。在RNA聚合酶Ⅱ的作用下细胞核中编码miRNA的基因转录成初级miRNA；再被核糖核酸酶(Drosha和Dgcr8)[8]加工形成长约70个核苷酸单位的茎环前体miRNA；此时细胞核内的前体miRNA通过核质转运蛋白运送至细胞质，由Dicer酶处理为成熟的miRNA产物[9]，成熟的miRNA产物加载到RNA诱导的沉默复合物中，与Argonaute(Ago)1～4[10]蛋白家族结合形成沉默复合物，并导向靶信使RNA，通过翻译抑制和靶信使RNA降解[11]来调节基因表达，从而发挥调控作用[12]。

2 miRNA与靶向治疗

缺血性脑卒中临床多急性起病，因脑部局灶缺血可形成复杂的级联反应(脑缺血缺氧→能量代谢障碍→兴奋性神经介质释放→自由基反应→钙过量内流→细胞凋亡)称为“缺血瀑布”。已有研究表明，miRNAs可用于治疗特定疾病，miRNA治疗的优点之一是可以人工合成miRNA模拟物和抑制剂改变内源性miRNA水平，目前已用于癌症和丙型肝炎治疗[13]。研究表明，miRNA分布广泛，作用于缺血性脑卒中的后循环和脑组织中[14]，并参与中枢神经系统的一些病理过程，阿尔茨海默病和多发性硬化也均与miRNA的特异性改变有关，表明miRNA可以作为临床的生物标志物，获得来源于外周血的“液体活检”[15]。miRNA和靶基因共同参与多种与缺血性脑卒中相关的病理生理过程，如动脉粥样硬化、神经血管再生、脑水肿、炎症反应、细胞凋亡等，提示miRNA可成为缺血性卒中早期诊断的生物标志物和有效的治疗靶标。研究表明，miR-21在不同类型脑卒中中均可作为生物标志物和治疗靶标[16]。Wang等[17]研究发现，miR-3473b通过靶向调控小胶质细胞抑制因子3诱导脑卒中神经炎发生，间接促使脑卒中的发生。Bukeirat等[18]研究发现，miR-34a影响线粒体活性，为靶向miR-34a治疗脑卒中、阿尔茨海默病等脑血管病和神经退行性疾病提供了新的治疗策略。

3 miRNA与脑缺血再灌注损伤

目前针对缺血性脑卒中患者的治疗主要是将血流受阻滞的脑组织及时再通，迅速恢复脑组织缺血部分的氧气和营养物质供应，维持正常代谢[19]。但在血流再灌注治疗过程中常会导致组织进一步受损，称为缺血再灌注损伤。缺血再灌注损伤的病理机制主要是脑组织中的白细胞增多堵塞毛细血管，细胞产生的各种毒性物质和细胞内出现的钙元素超载破坏细胞内线粒体的结构并损害细胞功能[20]，细胞内产生氧自由基导致高能磷酸化合物缺乏从而影响细胞能量代谢[21]。

miRNA是近年来发现的一种非编码、内源性的小RNA分子，广泛存在于真核生物中，通过抑制翻译水平来调节基因的表达，是一种重要的基因调控因子，临床研究和实验室研究均证明miRNAs是一种潜在的治疗脑缺血的靶分子。Sun等[22]用体外氧葡萄糖剥夺/再灌注和体内大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型研究miR-298和核因子κB激活剂1(nuclear factor kappa B activator 1,Act1)在缺血性脑卒中中的作用和机制，并采用实时荧光定量聚合酶链反应法评估miR-298与Act1的调节关系，检测结果表明miR-298直接结合到Act1转录本的3′端非翻译区。在体内外，miR-298通过转染模拟抑制Act1蛋白过表达，负调控Act1/c-Jun氨基端激酶/核因子κB信号和下游自噬通路，增强细胞凋亡和自噬，加重缺血性脑梗死和神经功能缺损，说明miR-298通过靶向Act1加重脑缺血再灌注损伤[23]。张军峰等[24]在体外模拟的脑缺血再灌注损伤的细胞模型中观察到氧葡萄糖剥夺/再恢复后细胞内miR-25表达下调，而miR-25过表达使细胞活力增强，凋亡减少，可能通过Bax/Bcl-2-caspase-3通路抑制细胞凋亡，提示脑缺血再灌注损伤治疗过程中miR-25可能会成为治疗的潜在靶点。还有研究表明，miR-29b通过靶向髓细胞白血病1影响脑缺血再灌注损伤期间的神经细胞凋亡[25]。

4 miRNA与动脉粥样硬化

缺血性脑卒中的发病机制主要与动脉粥样硬化引起的脑组织缺血有关[26]，动脉粥样硬化斑块的形成是动脉粥样硬化的标志，动脉粥样硬化斑块形成包括单核巨噬细胞聚集、内皮细胞损伤、脂质沉着、吞噬以及炎症反应等一系列重要过程[27]。内皮细胞的功能损伤能促进单核巨噬细胞的聚集和吞噬作用，或者产生慢性炎症反应等，使粥样性斑块在血管内膜下沉积生成。Gao等[28]纳入148例病例(其中大动脉粥样硬化组57例，动脉粥样硬化组41例，健康对照组50例)，通过受试者工作特征曲线证明了miR-126和miR-143识别动脉粥样硬化患者和健康对照者的能力，且具有较高的特异度(分别为73.3%和68.9%)和灵敏度(分别为85.6%和86.7%)，表明miR-126和miR-143可能是潜在的动脉粥样硬化的特异性生物标志物。

细胞凋亡在动脉粥样硬化的发展过程中扮演重要角色，作用程度取决于动脉粥样硬化斑块的阶段和凋亡细胞的类型[29]。Liu等[30]研究发现，miR-410抑制金属蛋白酶组织抑制因子2依赖的丝裂原活化的蛋白激酶通路对小鼠缺血性脑卒中后氧化应激诱导的细胞凋亡具有神经保护作用，提示提高miR-410表达及降低金属蛋白酶组织抑制因子2表达能促进细胞存活并抑制细胞凋亡，从而减少缺血性脑卒中的脑梗死面积，为缺血性卒中的治疗靶点提供新思路。另外，人们普遍认为颈动脉内膜增厚是动脉粥样硬化的症状，Huang等[31]用实时聚合酶链反应技术检测血浆miR-29c水平，用颈动脉超声检测颈动脉内膜厚度，发现颈动脉内膜增厚的患者miR-29c水平高于颈动脉内膜厚度正常的患者，表明miR-29c增加与颈动脉内膜厚度密切相关，可作为鉴别动脉粥样硬化患者的生物标志物。

5 miRNA与血管再生

缺血性脑卒中后的血管再生是一个极为复杂的过程，血管再生是使预先存在的毛细血管发展形成新的血管，通过增加脑血流量来治疗缺血性脑卒中的方法。已有研究表明，血管再生与神经功能恢复有密切关系，间充质干细胞衍生的外来体递送的miRNA可调节心脏、伤口和骨修复的炎症，而炎症反应和细胞因子是血管神经生成的关键促进因素[32]。Qing等[33]发现神经元和间充质干细胞可通过外泌体介导的神经系统细胞间通讯促进血管生成，一般以碱性成纤维细胞生长因子/小凹蛋白-1/血管内皮生长因子等信号通路促进脑缺血半暗区神经血管新生。He等[34]采用大鼠MCAO模型和氧-葡萄糖剥夺细胞模型，经逆转录聚合酶链反应和Western印迹分别检测miR-150和血管内皮生长因子的表达，用双荧光素酶测定确认miR-150和血管内皮生长因子之间的结合位点，发现miR-150可以负调控血管内皮生长因子的表达， miR-150表达上调可降低MCAO后大鼠梗死边缘区的血管密度，减少脑微血管内皮细胞的形成、增殖和迁移，表明miR-150可以通过血管内皮生长因子调控大鼠脑卒中后血管的新生。Ge等[35]采用液压打击法建立大鼠颅脑创伤模型，经定量逆转录聚合酶链反应检测损伤后0 h至 14 d 不同时间点miR-21表达水平，发现创伤灶脑皮质脑微血管内皮细胞中的miR-21表达增加，并在损伤后48 h达到峰值，通过激活与血脑屏障稳定相关的血管生成素1/酪氨酸激酶受体2通路，促进脑组织血管生成修复、减轻血脑屏障渗漏。Ge等[36]通过大鼠脑微血管内皮细胞体外划痕损伤模型，进一步研究miR-21-5p对细胞炎症和凋亡的影响发现一方面，miR-21-5p通过调节炎症细胞因子的表达和核因子κB信号通路抑制炎症反应；另一方面，miR-21-5p通过调节凋亡因子的表达和蛋白激酶B信号通路抑制细胞凋亡，同时在体外实验中也证实miR-21-5p可以促进血管生成素1/酪氨酸激酶受体2通路的激活，提示miR-21-5p通过抑制炎症和细胞凋亡，影响核因子κB、蛋白激酶B和血管生成素1/酪氨酸激酶受体2信号通路的活性，产生促进脑组织血管生成修复、减轻血管屏障渗漏的作用，受损脑组织中的血管生成可促进局部脉管系统的恢复，从而为神经重塑提供关键的神经血管基质，这对创伤性颅脑损伤后的神经元恢复具有重要意义，因此miR-21-5p也可能是治疗脑损伤后血脑屏障的靶点。

6 miRNA的临床和机制研究

miRNA作为基因表达调控的重要开关，几乎参与所有的生物学和病理过程。越来越多的临床和机制研究正趋于使用miRNA作为疾病诊断、治疗及预后的方法。Zou等[37]纳入了来自亚洲人群的14项病例对照进行Meta分析，基于6 083例缺血性卒中和7 248例对照(无任何神经系统疾病)，结果显示，在亚洲人群中，miR-146a(rs2910164)的GG基因型和miR-149的CC基因型(rs2292832)可能会增加缺血性脑卒中的易患性，提示这两个miRNA的基因型与缺血性脑卒中风险相关。年龄的增长与卒中患病率增加有关，有研究表明女性卒中较男性更严重，Selvamani和Sohrabji[38]使用模拟年龄为成年女性(6～7个月)和中年女性(10～12个月)的雌性大鼠，和同等数量年龄匹配的雄性大鼠进行MCAO处理，应用实时聚合酶链反应检测发现成年雌性大鼠组miR-363-3p表达升高，且梗死面积最小，而在成年雄性大鼠组和中年雄性大鼠组中却无明显变化，提示miR-363-3p对女性卒中具有神经保护作用，对女性卒中早期识别和治疗具有重要价值[39]。在卒中恢复期，miRNA也发挥重要作用。Edwardson等[40]使用上肢功能恢复作为神经修复的替代指标，于脑卒中后19 d，收集27例轻度和中度上肢损害的患者在脑卒中后关键期的血浆，恢复良好的22例患者中有6种miRNA(miR-371-3p，miR-524，miR-520g，miR-1255A，miR-453和miR-583)表达显著增加，3种miRNA(miR-941，miR-449b和miR-581)水平显著降低，提示表达上调的miRNA可能与神经修复机制有关，同时此类上调的miRNA对优化康复治疗时机、减轻卒中残疾负担具有重要意义。Zhang等[41]收集 251例急性缺血性卒中患者2周后的汉密尔顿抑郁量表，将其分为抑郁组和非抑郁组，找到与脑卒中后抑郁相关的潜在miRNA，通过对比抑郁患者与非抑郁患者的miRNA谱，发现某些差异miRNA，包括hsa-miR-4476、hsa-miR-887、hsa-miR-3615、hsa-miR-3202、hsa-miR-183-3p和hsa-miR-3184-3p等，其中某些miRNA与癌症相关，特别是与细胞凋亡和坏死有关，因此研究这些miRNA有助于尽早筛查出卒中后抑郁患者，血液miRNA可以作为抑郁诊断的潜在生物标志物，研究还发现严重神经功能缺损和颈动脉狭窄的患者更容易出现早发性抑郁，同时轻度卒中后抑郁与低密度脂蛋白之间也可能存在联系。

7 小 结

脑卒中是严重威胁我国居民健康及生命的主要疾病，2016年全球疾病负担数据显示，脑卒中是造成我国致残致死的第一位病因[42]。卒中的风险随着年龄的增加而增加，但也可发生在任何年龄[43]，因此早期监测和治疗是改善脑卒中预后的基本策略。miRNA可调控100多个基因靶点，一个基因也可被多个miRNA调控，这些分子可作为脑卒中不同阶段的诊断、预后和治疗性生物标志物[44]。然而脑卒中是一个复杂的病理过程，机体中的miRNA也存在复杂的调控系统[45]，利用miRNAs作为脑卒中的生物标志物具有很大潜力，与传统的疾病生物标志物相比，miRNAs能反映特定的细胞病理生理改变，可能提示出脑卒中的具体病因，并可能进行急性脑卒中的早期诊断和识别[46]。但目前缺血性卒中与miRNA的研究仍较少，且大多数可用于评估脑卒中miRNA临床有效性的研究均在亚洲人群中进行，因此这种结果可能不完全适用于其他种族，无法完全阐明miRNA对脑卒中患者的影响。另外，大多数miRNA启动子尚未被鉴定，miRNA的转录调控有待进一步明确[47]。因此，使用miRNA作为生物标志物和常规疗法相结合能否改善卒中患者的预后仍需更深入的研究。