虾头、虾壳抗氧化肽的分离纯化及其对秀丽隐杆线虫的抗氧化作用

王 晋，张 风，周爱梅*，黄炜超，王淑惠，罗旭洸

（华南农业大学食品学院，广东 广州 510642）

南美白对虾（Penaeus vannamei）是世界公认的优良养殖对虾品种之一，也是目前全世界养殖虾类产量最高的三大种类之一[1-4]，2016年我国依旧占据南美白对虾产量榜首地位，年产量超过40万 t。目前我国南美白对虾产业主要是以出口虾仁为主，因此在对虾加工的过程中产生了大量的虾头、虾壳等下脚料（约占整虾质量的30%～40%）[5-6]。这部分副产物含有丰富的蛋白质、甲壳素、不饱和脂肪酸（如二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸）以及各种氨基酸和人体必需的微量元素[7-8]。此外，虾头中的虾黄具有良好的风味，并且虾头、虾壳中还含有经济价值较高的甲壳质[6]。因此，对虾虾头、虾壳是一种优质的资源。但目前这些副产物大部分用于生产饲料和肥料，少部分用于生产甲壳素、壳聚糖[9]，产品的附加值低，因此对其开展深加工研究是一项重要课题。本课题组的前期研究表明，南美白对虾虾头、虾壳的酶解液具有较强的抗氧化活性，因此可进一步采用相关技术对酶解液进行分离纯化以获得高活性和高纯度的抗氧化活性肽，提高其经济价值[10]。目前的研究中所采用的分离纯化方法所获得的抗氧化肽的纯度较低[11]，抗氧化能力较弱[12]。国内外大多采用化学方法进行抗氧化活性评价[13-15]。因此，获得高纯度、高抗氧化活性的抗氧化肽以及采用体内抗氧化评价模型更好地检测抗氧化肽的活性是十分必要的。

采用老鼠或果蝇模型时，其检测指标多且复杂，实验周期长且费用昂贵。秀丽隐杆线虫（简称线虫）（Caenorhabditis elegans）具有稳定性好、寿命短、体型较小、短时间内可大量繁殖等诸多优点。此外，由于秀丽隐杆线虫有60%～80%的基因与人类的相关基因具有高度保守性，因此深受广大科研工作者的欢迎[16]。秀丽隐杆线虫在抗氧化方面的研究也有较多报道，目前已应用于抗衰老、延长寿命、抗氧化、毒性实验、脂肪代谢等研究[17]。Forno等[18]通过给N2野生型线虫喂食干果油，发现在氧化应激条件下，干果油能延长其寿命并对氧化应激造成的损伤起保护作用。

基于此，本实验在前期研究的基础上，以南美白对虾虾头、虾壳蛋白质的风味蛋白酶酶解液为原料，采用超滤、凝胶过滤色谱和制备液相色谱对其进行分离纯化，并以1,1-二苯基-2-苦基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率、还原力、氧化自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）为跟踪指标，获得纯度较高的抗氧化肽制品，进而采用秀丽隐杆线虫模型对其体内抗氧化活性进行评价。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

虾头、虾壳蛋白质为华南农业大学食品学院实验室自制，纯度为68.06%。秀丽隐杆线虫N2野生型由美国明尼苏达大学遗传学中心提供。

超滤管 美国Millipore公司；葡聚糖凝胶Sephadex G-50广州市齐云生物技术有限公司；DPPH 日本TCI公司；亚铁氰化钾、三氯化铁、铁氰化钾 天津市大茂化学试剂公司；VC 广州化学试剂厂；偶氮二异丁脒盐酸盐美国Sigma公司；水溶性VE（Trolox） 比利时Across Organics公司；乙腈 天津市富宇精细化工有限公司；胰蛋白胨、技术琼脂粉 广东环凯微生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

凝胶色谱层析柱（20 mmh400 mm） 马应龙药业集团股份有限公司；FD-IPF冷冻干燥机 北京德天佑仪器有限公司；LC-8A制备液相色谱系统 日本岛津公司；EnSpire酶标仪 美国PerkinElmer公司；LRH系列生化培养箱 上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 虾头、虾壳蛋白质酶解液的制备

取虾头、虾壳蛋白质（在氢氧化钠质量分数5%、料液比1∶10、提取时间100 min条件下制得，纯度为68.06%），采用风味蛋白酶酶解，酶解条件为：温度54 ℃、时间10.5 h、pH 8、加酶量8 000 U/g。酶解完成后，将酶解物混合液置于沸水浴加热灭酶20 min，4 000 r/min离心20 min后，收集上清液，冷冻干燥后即得酶解物，－20 ℃条件下冷冻保存备用。

1.3.2 虾头、虾壳蛋白酶解液中抗氧化肽的分离纯化

1.3.2.1 超滤处理

取酶解物溶解后，用截留分子质量分别为3 kDa和10 kDa的超滤管，将酶解液分成小于3 kDa、3～10 kDa、大于10 kDa 3 个部分，浓缩冻干后配制成0.1、0.2 mg/mL溶液。测试各组分的DPPH自由基清除率、还原力和ORAC，选择抗氧化活性最强的组分进行下一步的分离。

1.3.2.2 凝胶过滤色谱分离

将处理好的Sephadex G-50装成18 mmh350 mm的层析柱，将超滤后活性最强的组分用去离子水溶解为50 mg/mL，上凝胶过滤色谱柱。凝胶过滤色谱柱先用去离子水平衡，然后用去离子水以1 mL/min的流速洗脱，每3 mL收集为1 管，在波长220 nm处检测各管溶液的吸光度。收集各洗脱峰，浓缩及冷冻干燥后配制为0.1、0.2 mg/mL溶液，测试其DPPH自由基清除率、还原力、ORAC，筛选抗氧化活性最强的组分进行下一步的分离纯化。

1.3.2.3 制备液相色谱分离

将凝胶过滤色谱分离获得的抗氧化活性最强的组分收集浓缩，过0.45 µm滤膜后上制备液相色谱。制备液相色谱条件为：流动相A：0.1%（体积分数，下同）三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）；流动相B：乙腈＋0.1% TFA；梯度洗脱：0.0～5.0 min，5%流动相B；5～45 min，5%～45%流动相B；45～50 min，45%～95%流动相B；50～53 min，95%～5%流动相B；进样量4 mL；流速10 mL/min；检测波长220 nm。收集各洗脱峰，旋转蒸发浓缩及冷冻干燥后配制成0.1 mg/mL溶液，检测其DPPH自由基清除率、还原力、ORAC，筛选抗氧化活性最强的组分。

1.3.3 抗氧化肽的纯度检测

将制备液相色谱分离获得的活性最强的组分浓缩，过0.45 µm滤膜后，用分析型高效液相色谱检测其纯度。检测条件为：Spursil C18色谱柱（250 mmh4.6 mm，5 μm）；流动相A：0.1% TFA；流动相B：乙腈＋0.1% TFA；洗脱条件：5%～45%流动相B，40 min；进样量：20 µL；流速：1 mL/min；检测波长：220 nm。

1.3.4 抗氧化活性检测

1.3.4.1 DPPH自由基清除率的测定

参照Najafian等[19]的方法并加以改进。取2 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液（溶于体积分数95%乙醇溶液）和2 mL待测液，振荡混匀，室温避光放置30 min后在517 nm波长处测吸光度At，同时，测定样品溶液与蒸馏水混合的吸光度Ar，测定DPPH溶液的吸光度A0。设3 个平行，按式（1）计算DPPH自由基清除率。

1.3.4.2 还原力的测定

参照Wu Huichun等[20]的方法测定样品的还原力。取样品溶液2 mL，加入到2 mL磷酸盐缓冲液（0.2 mol/L、pH 6.6）和2 mL 1 g/L铁氰化钾溶液的混合液中。混合物于50 ℃保温20 min后，加入2 mL 10 g/L三氯乙酸。取2 mL反应混合物与2 mL蒸馏水以及0.4 mL 0.1 g/L氯化铁溶液反应10 min，测定其在700 nm波长处的吸光度。吸光度越大表明样品的还原力越强。以蒸馏水代替待测液，其他条件相同，所得溶液作空白调零。

1.3.4.3 ORAC的测定

参照戴卉卿等[21]的方法，结果以Trolox的浓度表示，即将样品荧光衰退曲线下的保护面积代入Trolox的线性方程中进行计算，得出样品的ORAC。

1.3.5 秀丽隐杆线虫实验评价抗氧化活性

1.3.5.1 给药途径

配制1 mg/mL抗氧化肽溶液和VC溶液，过滤除菌后，与大肠杆菌OP50菌液以质量比5∶95混合均匀。吸取100 µL于线虫生长培养基平板上喂养线虫。此条件下，药物通过线虫摄食而进入到线虫体内。

1.3.5.2 线虫的同期化

用1 mL M9缓冲液将培养3 d左右的年轻成虫洗至2 mL无菌EP管中，加入1 mL裂解液裂解线虫，振荡后3 000 r/min离心1 min，除去上清液。无菌操作下向EP管中加入1 mL M9缓冲液，振荡后离心，重复2 次。洗涤两次后的虫卵以M9缓冲液悬浮，混匀后加入到线虫生长培养基上，约48 h后虫卵基本发育成L4期幼虫，完成同期化操作。

1.3.5.3 线虫寿命的测定

线虫分为空白组（喂食与实验组相同体积的蒸馏水）和实验组。挑取同期化的L4期线虫于各组线虫生长培养基中，每个板中约30 条，每组3 个平板。从转移时刻开始计算线虫存活时间，转移当天记为寿命实验第0天，每天将它们转移到新的线虫生长培养基中，到生殖后期（通常为第4天）后每2 d将线虫转移到新的线虫生长培养基中以保证药物的质量浓度。隔天探视线虫，记录线虫生存、死亡数量及剔除出实验的数量[22]。

1.3.5.4 产卵量的测定

线虫分为空白组（喂食与实验组相同体积的蒸馏水）和实验组。每个线虫生长培养基中放置2 条线虫，每组5 个线虫生长培养基平板。每隔24 h将线虫转移至新的线虫生长培养基中，转移4～5 次后，线虫基本上已经不再产卵。将转移的线虫继续在培养箱中培养，20 ℃孵育24 h，对线虫进行计数，计算所有转移线虫生长培养基上的产卵量并除以2，即可得到每条线虫的产卵量[23]。

1.3.5.5 移动力的测定

在寿命实验的第4、8天和第12天观察并记录线虫的运动情况。记录标准：A型：线虫自发运动，不需要触碰刺激；B型：线虫必须受到触碰刺激才运动；C型：线虫受到触碰刺激后只摆动头或尾[24]。

1.3.5.6 线虫头部摆动次数的测定

将L4期的线虫转移到抗氧化肽组（添加抗氧化肽）、VC组（添加VC）和空白对照组（添加蒸馏水）3 种线虫生长培养基中，在第2天和第6天时观察线虫在30 s内的头部摆动次数，以此评价线虫的运动能力[25]。

1.3.5.7 热应激实验

取同期化的L4期线虫，转移到抗氧化肽组（添加抗氧化肽）、VC组（添加VC）和空白对照组（添加蒸馏水）3 种线虫生长培养基上，每组3 个线虫生长培养基平板，每个线虫生长培养基放置50 条线虫，20 ℃培养48 h。随后将线虫转移至37 ℃烘箱中处理1 h，然后置于20 ℃培养箱中恢复10 min，记录线虫的存活数量，按式（2）计算线虫存活率[26]。

1.4 数据统计分析

采用SPSS 16.0软件中的Duncan multiple进行显著性差异分析，P＜0.05为差异显著。采用Origin 8.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 抗氧化肽的分离纯化

2.1.1 超滤分离结果

超滤是一种膜分离技术，即在一定的压力下，小分子的溶质和溶剂能穿过一定孔径的特制薄膜，而大分子的溶质不能透过，留在了膜的另一边，从而实现了大分子和小分子物质的分离[27]。将南美白对虾虾头、虾壳的风味蛋白酶酶解液进行超滤处理，得到了3 个组分：分子质量小于3 kDa组分、3～10 kDa组分、大于10 kDa组分。如图1所示，超滤后各组分的DPPH自由基清除率、还原力和ORAC均随着样品质量浓度的增加而增加，但以分子质量为3～10 kDa组分的抗氧化活性最高。在质量浓度0.2 mg/mL和0.1 mg/mL时，3～10 kDa组分的DPPH自由基清除率分别为7.70%和2.67%，ORAC分别为82.82 µmol/L和57.80 µmol/L，均显著高于其他两个组分（P＜0.05）。分子质量为3～10 kDa组分在质量浓度为0.2 mg/mL时还原力达0.033，显著高于其他两个组分。

图1 酶解液超滤后各组分的DPPH自由基清除率（A）、还原力（B）和ORAC（C）Fig.1 DPPH radical scavenging capacity (A), reducing power (B) and ORAC (C) of each ultraf i ltration fraction

2.1.2 凝胶过滤色谱分离结果

凝胶过滤色谱根据被分离组分的分子质量不同将其分开，混合肽溶液在分离时，小分子多肽能进入凝胶颗粒内部的孔隙中，洗脱速度慢，而大分子多肽被排阻在凝胶颗粒外部，所以比小分子多肽更早地被洗脱下来。

图2 酶解液分子质量3～10 kDa组分凝胶过滤色谱图Fig.2 Gel fi ltration chromatography of peptides with molecular mass of 3–10 kDa

由图2可知，3～10 kDa组分经Sephadex G-50分离后被分成了5 个组分。

图3 酶解液凝胶过滤层析后各组分的DPPH自由基清除率（A）、还原力（B）和ORAC（C）Fig.3 DPPH radical scavenging capacity (A), reducing power (B) and ORAC (C) of each subfraction from gel fi ltration chromatography

由图3可知，凝胶过滤色谱所获得的5 个组分的DPPH自由基清除率、还原力和ORAC均随着质量浓度的增加而增加。其中峰2的DPPH自由基清除率、还原力、ORAC在0.2 mg/mL和0.1 mg/mL时都为最大，且均显著高于其他组分（P＜0.05），分别为8.06%和6.70%、0.089和0.030、181.94 µmol/L和99.23 µmol/L。表明抗氧化组分具有清除DPPH自由基、通过转移电子达到还原一些组分的能力和提供氢原子捕获自由基的能力。

2.1.3 制备液相色谱分离结果

图4 凝胶过滤酶解液峰2的制备液相色谱图Fig.4 Preparative liquid chromatogram of subfraction 2

由图4可知，凝胶过滤色谱得到的第2个峰经过制备液相色谱后被分成了9 个组分。

图5 酶解液制备液相色谱分离后各组分的DPPH自由基清除率（A）、还原力（B）和ORAC（C）Fig.5 DPPH radical scavenging capacity (A), reducing power (B) and ORAC (C) of each component from preparative liquid chromatography

由图5可知，在酶解液质量浓度0.1 mg/mL时，峰6的DPPH自由基清除率最强，为10.05%；峰3的DPPH自由基清除率也相对较高，为8.66%，其与峰6没有显著差异（P＞0.05），而其还原力与ORAC最高，分别为0.090 µmol/L和146.91 µmol/L，且显著高于其他组（P＜0.05）。以VC为阳性对照，0.1 mg/mL VC溶液的ORAC为76.82 µmol/L（未在图中显示），本研究所得抗氧化肽（峰3）的ORAC高于VC。由于ORAC法是目前普遍被接受的检测抗氧化能力的标准方法，具有接近机体生理条件、操作简单、准确性和认可度高等优点，广泛用于食品、药品、保健品等领域[28]。因此，选取峰3所得抗氧化肽进行后续的体内抗氧化实验。

2.2 抗氧化肽纯度检测结果

图6 制备液相色谱分离酶解液峰3高效液相色谱图Fig.6 High performance liquid chromatographic separation of peak 3 from preparative liquid chromatography

如图6所示，该组分存在一个大峰和一些很小的峰，根据峰面积归一法计算出该大峰的面积约占70%。说明该组分中含有一个纯度较高的抗氧化肽段，且所获得的抗氧化肽的纯度明显高于其他文献中报道的结果，如Shazly等[11]分离的抗氧化肽纯度为54.84%，范建凤等[12]从蟹下脚料获得抗氧化肽纯度最高为41.44%。

2.3 抗氧化活性评价结果

2.3.1 抗氧化肽对线虫寿命的影响

图7 各处理组对秀丽隐杆线虫寿命的影响Fig.7 Effect of the purif i ed antioxidant peptides on the life span of C. elegans

如图7所示，空白对照组线虫的平均寿命为17.82 d，VC组线虫的寿命为19.03 d，而喂食抗氧化肽的线虫的平均寿命达到了19.62 d。VC组和抗氧化肽组线虫的寿命显著长于空白对照组（P＜0.05），但两者间无显著性差异（P＞0.05）。结果表明，抗氧化肽处理可以延长线虫的平均寿命，说明抗氧化肽可通过清除线虫体内的自由基，增强线虫的抗氧化应激能力，从而产生抗氧化保护作用。

2.3.2 抗氧化肽对线虫生殖能力的影响

图8 不同处理组秀丽隐杆线虫的产卵量Fig.8 Fecundity of C. elegans in different treatment groups

由图8可知，各组处理中，线虫的生育高峰均为第1天和第2天，产卵量远高于其他时间。由不同处理组线虫的总产卵量结果可得，空白对照组、VC组、抗氧化肽组每条线虫产卵量分别为142.40、166.30 个和175.50 个。VC组和抗氧化肽组线虫的产卵量均显著高于空白对照组（P＜0.05）。说明本研究所得抗氧化肽可以提高线虫的生殖能力。

2.3.3 抗氧化肽对线虫移动力的影响

图9 不同时期秀丽隐杆线虫移动力Fig.9 C. elegans movement force after treatment with antioxidants for different periods

如图9所示，自发运动的线虫所占比例随着寿命的延长呈逐渐下降的趋势，但是空白对照组、VC组和抗氧化肽组三者差异不大。线虫受到触碰才运动的比例随着时间的延长而逐渐增加，3 组差异不大。线虫受到触碰后只摆动头部或尾部的比例在第4天时各组均为0%，而到了第8、12天后比例逐渐增加。说明随着线虫衰老程度的增加，线虫的移动力呈逐步下降的趋势。但是实验组和空白对照组的移动力差异不大。

2.3.4 抗氧化肽对线虫头部摆动次数的影响

图10 不同处理组秀丽隐杆线虫的头部摆动次数Fig.10 Head swinging frequency of C. elegans in different treatment groups

如图10所示，第6天时线虫的头部摆动次数均低于第2天，说明在线虫的衰老过程中，其运动行为能力逐渐下降。与空白对照组相比，VC组和抗氧化肽组线虫的头部摆动次数均没有明显提高，三者没有显著差异（P＞0.05）。结果表明，本研究所得抗氧化肽对线虫运动行为能力中的头部摆动次数没有显著影响。说明抗氧化肽在提高线虫寿命和生殖能力的前提下，没有对线虫的运动行为能力造成不利影响。

2.3.5 抗氧化肽对热应激条件下线虫存活率的影响

图11 热应激条件下秀丽隐杆线虫的存活率Fig.11 Survival rates of C. elegans under heat stress

如图11所示，在37 ℃烘箱中处理1 h后，抗氧化肽组、VC组、空白对照组的线虫存活率分别为59.33%、46.67%和42.00%。抗氧化肽处理可显著提高线虫的存活率（P＜0.05），其比空白对照组提高了41.26%，比VC组提高了27.13%。Zhang Longze等[29]在研究茶多酚对秀丽隐杆线虫寿命影响的实验中发现，在35 ℃热应激的条件下，预先用茶多酚处理48 h的线虫的存活率显著提高。研究结果表明在热应激条件下，抗氧化肽处理可以显著提高线虫的存活率。

3 讨 论

以DPPH自由基清除能力、还原力和ORAC为指标，对风味蛋白酶最佳水解条件下得到的酶解液进行分离纯化。经超滤、凝胶过滤色谱和液相制备色谱分离后，获得了一个纯度和抗氧化活性均较高的肽段。

采用秀丽隐杆线虫模型，通过对线虫寿命、产卵量、运动能力、移动力和热应激条件下的存活率等指标的测定，评价抗氧化肽通过清除线虫体内的自由基从而对其产生的抗氧化保护作用。

氧化应激被认为是线虫衰老的关键因素，线虫的抗氧化应激能力和寿命有较好的相关性[30]。本研究中，抗氧化肽处理可以延长线虫的平均寿命，说明抗氧化肽通过清除线虫体内的自由基，增强线虫的抗氧化应激能力，从而产生抗氧化保护作用。

产卵量主要反映了线虫的生殖能力，因此测定线虫的产卵量能研究所得抗氧化肽对其生殖能力方面的影响。本研究结果说明抗氧化肽对线虫生殖能力具有保护作用。

头部摆动次数反映了线虫的运动行为能力，移动力同样也反映了线虫的运动情况，通过对线虫头部摆动次数和移动力的检测推测抗氧化肽在提高线虫其他生理功能的同时是否会损害其运动行为能力。本研究结果表明，抗氧化肽组、VC组和空白对照组的差异不大，说明抗氧化肽在延长线虫寿命和提高生殖能力的前提下，没有对线虫的运动行为能力造成不利影响。

机体在压力环境下的抵抗能力被称为压力应激能力，压力状态下线虫的应激能力与其寿命之间存在着很强的相关性。研究表明，许多长寿型突变体线虫都是伴随着压力应激能力的提高而寿命延长的[31]。热应激实验考察的是线虫对急性氧化损伤的抵抗能力，实验结果表明抗氧化肽能够显著提高线虫在压力环境下的存活率。在热应激条件下，抗氧化肽处理同样可以显著提高线虫的存活率，得到该结果的原因可能是抗氧化肽的自由基清除作用以及提高应激相关的蛋白质的调节作用等。提高线虫在压力条件下的应激能力可能是抗氧化肽延长线虫寿命的作用机理之一。

综上所述，喂食抗氧化肽的秀丽隐杆线虫的产卵量、寿命和热应激条件下的存活率均显著高于空白对照组（P＜0.05），且与VC组没有显著差异（P＞0.05）。其移动力、头部摆动次数与空白组、阳性对照组均没有显著差异（P＞0.05）。本研究所获得的抗氧化肽对秀丽隐杆线虫具有和VC相当的抗氧化保护作用。