丁香精油纳米胶囊对冷藏调理猪肉饼品质的影响

张慧芸，何 鹏，李鑫玲，康怀彬*

（河南科技大学食品与生物工程学院，河南 洛阳 471023）

近年来，随着人们生活节奏的加快和生活水平的提高，消费者对调理肉制品和即食肉制品的需求迅速增长；同时化学合成防腐剂和抗氧化剂的安全性问题也越来越引起人们的广泛关注。采用对产品或环境无任何不良影响的天然抗氧化剂和抗菌剂代替传统化学添加剂改善肉及肉制品品质已成为目前研究热点[1]。在食品工业中，香辛料和草药不但可被用作风味剂赋予食品一定的风味、香气和辛辣感，也可以作为天然保鲜剂用于食品保藏[2]。大量研究发现精油作为天然抗氧化剂或抗菌剂使用可保持和改善肉和肉制品的整体品质[3-5]。丁香精油是从丁香树的花蕾、叶子等提取的芳香精油，具有良好的抑菌和抗氧化效果[6-8]，为我国GB 2760ü2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》[9]规定允许使用的食用香料。然而精油与食物组分之间的相互作用及精油的高挥发性、低水溶性，特别是较高浓度的精油会给食品的感官品质带来负面影响以及精油在加工、使用和储存过程中对氧、光和热较为敏感等原因[2]，限制了精油作为食品防腐剂的应用。微胶囊化精油是提高精油溶解度和稳定性的最有效技术之一，微胶囊化可以掩盖精油的不良味道和气味，控制活性物质的释放[10]。近年来，纳米级生物活性物质的开发成为研究热点，与传统微胶囊相比，亚细胞尺寸的纳米胶囊具有相对较高的细胞吸收和特异性，同时具有较高的载药能力和生物活性物质释放面积，生物活性高[11]。

由于壳聚糖具有生物相容性、低毒性和生物可降解性，壳聚糖纳米微粒非常适合作为壁材包埋精油[12]。此外，壳聚糖具有广泛的生物活性，包括抗菌、抗氧化、杀虫和黏结性。壳聚糖具有包埋疏水性和亲水性生物活性物质的潜力，在食品和医药领域有广阔的应用前景[10,12-13]。已有文献报道添加精油的可食用膜在肉制品中的应用[14-16]，但关于胶囊化精油对肉制品的保鲜效果研究甚少。本实验采用离子凝胶法，以壳聚糖为壁材制备丁香精油纳米胶囊，研究丁香精油纳米胶囊的物理性能及其对调理猪肉饼4 ℃冷藏期间菌落总数、脂肪氧化、色差、pH值、高铁肌红蛋白含量以及感官品质的影响，为开发应用新型肉及肉制品保鲜剂提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

壳聚糖（脱乙酰度95%） 南通兴成生物制品厂；丁香精油（丁香酚质量分数＞90%） 上海铭睿生物科技有限公司；三聚磷酸盐、冰醋酸、三氯乙酸、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA） 国药集团化学试剂有限公司；吐温-80、甘油 天津市德恩化学试剂有限公司；营养肉汤和营养琼脂培养基 北京陆桥技术有限责任公司。

1.2 仪器与设备

DHG-9003型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；UV-2450PC紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；PHS-3C pH计 上海精科有限公司；CR-400便携式色差仪 日本Konica Minolta公司；ZFS高速搅拌机 上海臻煊机电科技有限公司；DV-1数字式黏度计上海伦捷机电仪表有限公司；Zeta Sizer-3000HSA型动态光散射激光粒度仪、Sizer-2000型Zeta电位测定仪 英国Malvern公司。

1.3 方法

1.3.1 丁香精油纳米胶囊的制备

参考Ghaderi-Ghahfarokhi等[10]的方法，采用离子凝胶法制备丁香精油纳米胶囊。将壳聚糖溶于体积分数1%冰醋酸中，制成3.2 mg/mL的壳聚糖溶液，超声水浴1 h，采用微孔滤纸过滤，调节滤液pH值至4.0。取50 mL上述壳聚糖溶液加入80 mg吐温-80，60 ℃ 搅拌 30 min得到均匀混合物。取128 mg精油溶于4 mL体积分数95%乙醇中，将精油逐滴加入冷却的壳聚糖溶液中，壳聚糖与精油的质量比为1∶0.8，1 200 r/min搅拌20 min。取30 mL 1.87 mg/mL三聚磷酸盐（pH 4.0）逐滴加入壳聚糖-精油乳化液中，900 r/min持续搅拌60 min，形成丁香精油纳米胶囊悬浮液。

1.3.2 丁香精油纳米胶囊物理特性的研究

1.3.2.1 粒径、ζ-电势和多分散指数的测定

采用动态光散射激光粒度仪测定纳米胶囊粒径和多分散指数。多分散指数值表示粒径分布的不均匀性，多分散指数值接近0表示粒径均匀分布，接近1表示粒径分布不均匀。采用Zeta电位测定仪测定纳米胶囊ζ-电势。

1.3.2.2 包埋率和累积释放率

参考Keawchaoon等[17]的方法测定丁香精油纳米胶囊的包埋率和累积释放率。

包埋率的计算见式（1）。

采用24 000 r/min低温（4 ℃）离心45 min，从1.3.1节制得的悬浮液中分离出壳聚糖-精油纳米胶囊，将其悬浮在5 mL醋酸盐缓冲溶液（pH 5）中200 r/min振摇。不同时间取样，9 000 r/min离心5 min，取1 mL上清液加入等体积的新配制醋酸盐缓冲溶液中。采用紫外-可见分光光度计测定285 nm波长处吸光度，并计算精油释放量。精油累积释放率计算见式（2）。

式中：mt为各采样时间的精油释放量/mg；m0为初始负载精油质量/mg。

1.3.3 猪肉饼的制备方法

超市购新鲜猪肉，去除筋膜及多余的脂肪，瘦肉与肥肉的质量比为4∶1，然后用绞肉机绞碎，按碎肉质量加入2%食盐、0.2%复合磷酸盐、3%淀粉、0.6%卡拉胶、15%冰水混匀后，随机分成5 组，第1组为对照组（control），第2、3组按质量分别添加0.05%、0.10%丁香精油（分别记作0.05% CLEO、0.10% CLEO），第4、5组按质量分别添加0.05%丁香精油纳米胶囊、0.10%丁香精油纳米胶囊（分别记作0.05% CLEO-CNS、0.10% CLEO-CNS），手动搅拌均匀后，放入斩拌机中，用最低斩拌速率（刀速1 400 r/min、锅速10 r/min）充分斩拌，制成大约7.5 cm（直径）×1.5 cm（厚度）的肉饼。每两个肉饼放入聚丙烯托盘中，用聚乙烯保鲜膜封好，（4f1）℃下保存，分别在第0、2、4、6、8天测定各项指标。

1.3.4 丁香精油纳米胶囊对冷藏调理猪肉饼品质的影响

1.3.4.1 菌落总数的测定

菌落总数的测定参考GB 4789.2ü2016《食品安全国家标准 食品卫生微生物学检验 菌落总数测定》[18]。该标准规定新鲜肉菌落总数为1～104CFU/g，次鲜肉为104～106CFU/g，变质肉超过106CFU/g。称取被检样品10 g，放入90 mL无菌生理盐水中，在摇床中振摇30 min，然后取1 mL上清液进行加倍递增稀释，采用普通营养琼脂培养基平板倾注法，在37 ℃下有氧培养48 h后计数，结果以菌落总数的对数值表示。

1.3.4.2 TBARS值的测定

硫代巴比妥酸反应物（thiobarbituric acid-reactive substances，TBARS）值的测定参考Zhang Lin等[19]的方法，略加改进。取1 g肉样加入10 mL蒸馏水，12 000 r/min匀浆3 次，每次30 s。取0.2 mL匀浆液，依次加入0.2 mL、质量分数8.1%十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）溶液、1.5 mL体积分数20%醋酸缓冲液、1.5 mL质量分数0.8% TBA溶液和0.6 mL蒸馏水，混匀后沸水浴中保持30 min，用流动的自来水冷却至室温，加入4 mL氯仿混匀，3 000 r/min离心10 min，532 nm波长处测吸光度。用1,1,3,3-四乙氧基丙烷做标准曲线，TBARS值以每千克肉样所含丙二醛的质量表示，单位为mg/kg。

1.3.4.3 pH值和色泽的测定

pH值的测定按照GB 5009.237ü2016《食品安全国家标准 食品pH值的测定》[20]。色差测定参照Rubio等[21]的方法，并略作修改。色差仪使用前先用标准板进行校正，采用D65光源、8 mm直径测量范围及10°标准观察角对肉饼表面的色泽（亮度L*、红度a*、黄度b*）进行测定。每个样品取上表面均匀分布的6 处不同位置进行测量并求其平均值。

1.3.4.4 高铁肌红蛋白质量分数的测定

高铁肌红蛋白质量分数参照Krzywicki[22]的方法，并加以改进。取5 g肉样置于已加有5 mL冰冷磷酸缓冲液（pH 6.8，40 mmol/L）的50 mL聚乙烯离心管中，4 000 r/min均质20 s，4 ℃、10 000 r/min冷冻离心15 min，过滤取上清液，分别测量525、545、565、572 nm波长处的吸光度（A），以磷酸缓冲液为对照。

式中：R1、R2、R3分别是吸光度比值A572nm/A525nm、A565 nm/A525 nm、A545 nm/A525 nm。

1.3.4.5 感官分析

参照Pohlman等[23]的方法进行感官分析。采用5 分制评定肉样的颜色、气味、精油气味和总体可接受性。其中5 分为非常喜欢，1 分为非常厌恶，3 分以下为不可接受。感官评定小组由10 名经过培训的成员组成，均来自河南科技大学食品与生物工程学院。感官评定在控制温度、湿度及灯光的单独感官评定小室中进行。分别在冷藏0、4、8 d取样进行感官评定。

1.4 数据分析

所得数据均为3 次重复的平均值，用Statistix 8软件进行数据分析，通过最小显著差值（least significant difference，LSD）进行差异显著性分析，用SigmaPlot 9.0软件作图。

2 结果与分析

2.1 丁香精油纳米胶囊的物理性能

丁香精油纳米胶囊的平均粒径为254.7 nm，ζ-电势为35.4 mV，多分散指数为0.33。精油包埋率为39.65%，此结果高于Woranuch等[13]报道的壳聚糖-丁香酚纳米胶囊的包埋率。

图1 丁香精油纳米胶囊的释放曲线（pH 5.0）Fig.1 Release curve of clove essential oil nanocapsules at pH 5.0

为模拟丁香精油纳米胶囊在食品中的释放机制，采用醋酸盐缓冲溶液作为释放基质。由图1可以看出，精油的累积释放率初始阶段快速上升，随后缓慢增加，最终达到平稳期。在第一阶段，在最初9 h内丁香精油的释放速率最快，精油的累积释放率为40.54%，一方面是由于纳米胶囊表面的游离精油和包埋在纳米胶囊表层附近的精油瞬时扩散；另一方面是由于纳米胶囊表面附近的浓度差较大和壳聚糖聚合物的溶解速率高。第二阶段释放速率逐渐降低，直到69 h后达到恒定值；精油释放率从40.54%上升到63.59%，这主要是由精油在纳米胶囊中的扩散作用和壳聚糖聚合物的降解引起的；108 h后停止释放。释放曲线结果表明丁香精油纳米胶囊具有在猪肉饼贮藏过程中持续释放精油的潜力。

2.2 丁香精油纳米胶囊对猪肉饼冷藏期间菌落总数的影响

图2 丁香精油纳米胶囊对猪肉饼冷藏期间菌落总数的影响Fig.2 Effect of clove essential oil nanocapsules on APC of pork patties during storage at 4 ℃

由图2可知，冷藏结束时，与对照组相比，0.05% CLEO和0.10% CLEO处理组菌落总数分别降低了1.49、2.35（lg（CFU/g）），0.05% CLEO-CNS和0.10% CLEO-CNS处理组菌落总数分别降低了2.51（lg（CFU/g））和2.89（lg（CFU/g））。CLEO和CLEO-CNS处理组猪肉饼货架期延长了2～4 d。精油的组成影响其抗菌性能，丁香精油主要成分为丁香酚、β-丁香烯、乙酰丁香酚以及甲基正戊基酮、水杨酸甲酯等[22]。丁香酚对酶（如细菌ATP酶或霉菌细胞壁合成酶）活性具有很好的抑制作用，并且可以干扰细菌细胞膜的合成[2,23]。丁香精油纳米胶囊能够有效控制丁香精油的释放，而丁香精油只是短期内能降低微生物数量。Sadgrove等[26]研究表明，将茶树精油制成微胶囊可提高精油的抗菌活力，因此推断将精油包埋可减少精油的挥发，有利于其向细菌细胞壁的迁移。Keawchaoon等[17]研究表明，质量浓度低于8.23 mg/mL的壳聚糖纳米粒子对微生物没有抑制作用。

2.3 丁香精油纳米胶囊对猪肉饼冷藏期间TBARS值的影响

图3 丁香精油纳米胶囊对猪肉饼冷藏期间TBARS值的影响Fig.3 Effect of clove essential oil nanocapsules on TBARS value of pork patties during storage at 4 ℃

由图3可知，随着贮藏时间的延长，对照组TBARS值显著升高，贮藏结束时达到1.49 mg/kg。Sheard等[27]指出当猪肉或牛肉TBARS值大于0.5 mg/kg时，可闻到肉制品的酸败味。各处理组TBARS值随着贮藏时间的延长逐渐升高，但除了0.05% CLEO处理组以外，其他处理组TBARS值都没有超过感官临界值（0.5 mg/kg）。丁香酚具有较强的抑制丙二醛生成的抗氧化活性，Kong Baohua等[28]报道了丁香提取物能显著抑制猪肉饼的脂质二级氧化，与本研究结果一致。本研究结果表明，丁香精油纳米胶囊在较低含量时即可抑制脂质氧化，可以推断微胶囊化可防止精油在贮藏过程中的挥发和分解。此外，壳聚糖具有一定的抗氧化活性，壳聚糖可与脂肪衍生物相互作用，并具有螯合肌红蛋白释放的铁离子的能力。Jung等[29]报道了采用涂布微胶囊辣根提取物的普通塑料膜包装能显著抑制猪肉和鱼肉中丙二醛的产生，与本研究结果一致。

2.4 丁香精油纳米胶囊对猪肉饼色泽的影响

表1 丁香精油纳米胶囊对猪肉饼冷藏期间色泽的影响Table1 Effects of clove essential oil nanocapsules on color of pork patties during storage at 4 ℃

由表1可知，在贮藏初期，0.05% CLEO处理组和0.10% CLEO处理组L*值显著高于其他处理组（P＜0.05）。随着贮藏时间的延长，对照组和各处理组L*值均显著增加（P＜0.05），但0.05% CLEO-CNS处理组和0.10% CLEO-CNS处理组L*值增加缓慢，在贮藏末期与对照组相比差异显著（P＜0.05）。

随着贮藏时间的延长，对照组和各处理组a*值呈逐渐降低趋势，在贮藏初期各组之间差异不显著（P＞0.05）。在贮藏结束时，对照组、0.05% CLEO、0.10% CLEO、0.05% CLEO-CNS、0.10% CLEO-CNS处理组a*值与初始相比分别降低了34.9%、34.4%、32.1%、25.8%、13.2%。虽然0.10% CLEO-CNS处理组在贮藏前2 d的a*值有所降低，但在以后的贮藏过程中a*值趋于稳定，这与丁香精油纳米胶囊的缓释作用有关[30]。

随着贮藏时间的延长，对照组和处理组b*值逐渐增加。贮藏结束时，CLEO处理组b*值与对照组接近。添加丁香精油纳米胶囊抑制了肉样b*值的增加，贮藏结束时，0.10% CLEO-CNS处理组b*值最低，与对照组相比差异显著（P＜0.05）。这可能是由于丁香精油纳米胶囊抑制了高铁肌红蛋白的形成。Hu Jing等[31]研究表明，添加肉桂精油微胶囊显著抑制了冷却猪肉贮藏过程中b*值的增加。

2.5 丁香精油纳米胶囊对猪肉饼pH值的影响

肉样最初pH值为5.84～5.86。由图4可以看出，随着贮藏时间的延长，对照组与处理组肉饼pH值均稍有升高，其中对照组pH值升高明显，在贮藏结束时达到6.01，这可能是微生物降解氨基酸产生的挥发性碱（如氨和三甲胺）积累引起的[32]。在贮藏6 d后，CLEO-CNS处理组pH值显著低于对照组（P＜0.05），说明丁香精油纳米胶囊在猪肉饼冷藏期间更好地发挥了抑菌作用，降低了猪肉饼的腐败变质程度。

2.6 丁香精油纳米胶囊对猪肉饼高铁肌红蛋白质量分数的影响

图5 丁香精油纳米胶囊对猪肉饼冷藏期间高铁肌红蛋白质量分数的影响Fig.5 Effect of clove essential oil nanocapsules on MMb content of pork patties during storage at 4 ℃

高铁肌红蛋白的积累是导致生肉糜逐渐由红色变为褐色的主要原因[33]，可通过降低高铁肌红蛋白浓度提高氧合肌红蛋白浓度，从而保留肉的鲜红色。如图5所示，随着贮藏时间的延长，对照组和处理组高铁肌红蛋白质量分数逐渐升高，这也证实了样品红度a*值的降低。猪肉饼冷藏4 d后，CLEO处理组和CLEO-CNS处理组高铁肌红蛋白质量分数显著低于对照组（P＜0.05），这可能由于丁香精油具有清除肉中产生的自由基的能力；CLEO-CNS处理组高铁肌红蛋白质量分数显著低于CLEO处理组（P＜0.05），这与丁香精油纳米胶囊的缓释作用有关。贮藏结束时，对照组、0.05% CLEO、0.10% CLEO、0.05% CLEO-CNS、0.10% CLEO-CNS处理组高铁肌红蛋白质量分数分别为70.58%、62.15%、59.00%、48.23%、42.19%，相互之间差异显著（P＜0.05）。因此，添加胶囊化精油显著提高了肉样的红色稳定性。

2.7 丁香精油纳米胶囊对猪肉饼感官指标的影响

表2 丁香精油纳米胶囊对猪肉饼冷藏期间感官指标的影响Table2 Effect of clove essential oil nanocapsules on sensory attributes of pork patties during storage at 4 ℃

由表2可知，贮藏结束时，对照组、0.05% CLEO和0.10% CLEO处理组的颜色分值降低到感官不可接受分值（3 分）以下，而0.05% CLEO-CNS和0.10% CLEO-CNS处理组仍呈现可接受的红色，这与色泽和高铁肌红蛋白质量分数测定结果一致。对于气味分值，对照组第4天降到2.7 分，而CLEO和CLEO-CNS处理组在第8天仍均高于3 分。肉品中不良气味的产生主要与脂质氧化产物如丙二醛和微生物腐败有关；对于丁香精油气味，0.10% CLEO处理组分值在贮藏过程中始终低于3 分，感官上不可接受；CLEO-CNS处理组的精油气味分值随贮藏时间的延长而降低，但在第8天并没有达到不可接受分值，这是由于精油的缓慢释放作用。因此，将精油胶囊化不但保留了精油的抗氧化和抗菌活性，同时可得到令人满意的感官品质。

与初始相比，第4天时，对照组、0.05% CLEO、0.10% CLEO处理组的总体可接受性下降，低于最低总体可接受分值。0.05% CLEO-CNS和0.10% CLEO-CNS处理组在第8天时仍具有较高的总体可接受分值，分别为3.80 分和4.07 分，这是由于添加的胶囊化精油显著抑制了猪肉饼在冷藏过程中的变色、脂质氧化和微生物生长。感官评分结果表明，将精油胶囊化可避免较高浓度精油的强烈气味对产品造成的不良影响。

3 结 论

本研究结果表明，单独使用丁香精油虽然可以抑制猪肉饼微生物腐败和脂质氧化，但其对猪肉饼感官品质负面影响较大；且随着冷藏时间的延长，丁香精油逐渐挥发，导致其抗氧化和抗菌活性下降。由于丁香精油纳米胶囊具有缓释作用，将其添加到猪肉饼中不仅延长了其抗菌抗氧化作用时间，显著抑制了猪肉饼脂质氧化和微生物生长，且对猪肉饼冷藏期间的感官指标没有不良影响。本研究为运用纳米胶囊技术开发新型天然肉制品保鲜剂提供了理论依据。