基于核磁共振氢谱及偏最小二乘判别分析法的红木快速识别模型的建立与应用

陈碧莹，廖世莉，吴 霞，冯毅凡

(广东药科大学 中心实验室，广东 广州 510006)

红木作为珍贵的家具用材，制作而成的家具和工艺品等备受青睐，价值极高[1]。根据国家红木标准(GB/T 18107-2000)[2]，可将红木分为5属8类，共29种。不同种类、不同产地的红木之间价格差异较大。目前红木鉴别仍以人工鉴别为主，而人工鉴别能力参差不齐，加之市场上真假红木鱼目混珠，使得消费者不能有效地识别真伪，易造成损失。国标红木中俗称为小叶紫檀的檀香紫檀，在市场上价格较高，而染料紫檀因价格低廉、形似檀香紫檀的特点，常被混作檀香紫檀。胶漆树也因外观类似紫檀，常被冒充作为红木使用。

目前常用的传统鉴别红木的方法为观测红木木材的材色、纹理、气味及其显微结构等[3-5]。近年来，化学检测手法也被逐步应用于红木鉴别。红外光谱法[6-9]和气相色谱法[10-12]是目前较为常用的鉴别红木的化学方法，但两者均易受仪器和环境影响，且气相色谱法的样品前处理较繁琐。

核磁共振技术具有检测快速、样品处理简单、灵敏度高、无偏向性等优点，其中，核磁共振氢谱被越来越多地应用于植物指纹图谱的构建[13]。而仅靠人工鉴别对核磁共振仪这种高通量仪器所产生的庞大数据进行分类不仅不现实，还会丢失大部分有用的信息[14]。模式识别方法结合了计算机、统计学、数学等知识，从化学测量数据出发，进一步揭示物质的隐含性质，可有效地解决数据处理的难题[15]，为分析化学研究提供十分有用的决策性信息。偏最小二乘判别分析(PLS-DA)法是模式识别中常用的方法之一。

本研究将1H NMR与PLS-DA结合，对奥氏黄檀、巴里黄檀、交趾黄檀、刺猬紫檀、大果紫檀和檀香紫檀6类国标红木，及胶漆树、染料紫檀2类混淆品进行快速鉴别，尝试建立有效区分上述6类国标红木及其2类混淆品的有效方法。

1 实验部分

1.1 实验样本

实验样本名称及其来源如表1所示。建模所需的8类共75批次的样本和从市场上购得的未知样本X-1和X-2均取自木材心材部分，研磨，过40目筛，置于干燥器中常温保存。

表1 样本名称及其来源Table 1 Name and resource of samples

1.2 仪器与试剂

AVANCE Ⅲ500MHz 超导NMR波谱仪(瑞士Bruker公司)，正相检测探头(BBO多核宽带探头，瑞士Bruker公司)，MestReNova软件，5 mm直径核磁管(美国Norell公司)，氘代甲醇MeOD(美国Sigma公司)。AUWD220D型分析天平(日本岛津公司)，1 000 μL移液枪、高速离心机(美国Thermo公司)，KQ-250B型超声波清洗器(昆山市超声波仪器厂)。

1.3 实验方法

1.3.1样品溶液的制备称取0.1 g样品，加入1 mL氘代甲醇，超声30 min，13 000 r/min离心10 min，上清液转移至5 mm核磁管，加封，即得核磁测试供试品。

1.3.21HNMR光谱分析仪器工作条件：温度：295 K；频率：500.13 MHz；序列：zgpr(预饱和单脉冲)；90°脉冲宽度：14 μs；扫描次数：24；扫描谱宽：16 ppm(1H NMR)；弛豫延迟：1.0 s；时域数据点数：64 k。

1.4 数据处理

1.4.11HNMR数据处理使用MestReNova软件，将1H NMR图谱分别进行相位矫正、基线矫正、扣除溶剂峰和水峰、归一化和分段积分(0.04 ppm)等处理，导出数据。

1.4.2模式识别分析使用RStudio 3.3.2软件和mixOmics 6.3.0包，对导出的核磁数据进行聚类分析、PCA和PLS-DA处理(参数设置：center=FALSE，scale=FALSE，其余参数选取默认值)。

2 结果与讨论

2.1 6类国标红木及2类混淆品的1H NMR图

经过相位矫正、基线矫正、扣除溶剂峰和水峰等处理的6类国标红木及2类混淆品的1H NMR图谱如图1所示，图中随机选取8类样本的1H NMR图谱构建叠加图。由图可知，不同种类间红木甲醇提取液的1H NMR图有较大差异，因此，利用化学检测手段将其分类具有可行性。

图1 6类国标红木及2类混淆品的1H NMR图

2.2 红木分类模型的建立

2.2.16类国标红木及2类混淆品红木的聚类分析结果聚类分析根据相类似的样本在多维空间中彼此的距离小，不相似的样本在多维空间中彼此的距离大而达到分类的目的。6类国标红木及2类混淆品红木的聚类分析结果如图2所示，图中显示了8组共75个样本。由图可知，刺猬紫檀(P.eri.)组、染料紫檀(P.tin.)组、大果紫檀(P.mac.)组和胶漆树(G.sp.)组能较好地分组，其余各组间或有交集，并不能很好地进行区分。聚类分析能有效地将混淆品组与国标红木组进行有效区分，但不同类别间的国标红木组并不能得到有效地分类。

图2 6类国标红木及2类混淆品的聚类分析结果

图3 6类国标红木及2类混淆品的PCA结果

2.2.26类国标红木及2类混淆品红木的PCA结果6类国标红木及2类混淆品红木的PCA结果如图3所示。由图可知，PCA转换后PC1和PC2的贡献率分别为56%和15%，累积贡献率达71%。贡献率越大，表明其所含的信息越多，越能代表原始的数据。在PCA模型中，除大果紫檀组能较好地分组外，其余各组间或有交集，国标红木组与混淆品组、不同类别的国标红木组间均不能达到较好地区分。因此，PCA不适用于红木的快速鉴别分析。

2.2.36类国标红木及2类混淆品红木的PLS-DA结果PLS-DA是一种有监督的模式识别方法,能减少变量间多共线性所产生的影响，即自变量间的共线性越低，使用PLS-DA的效果越好。本文中1H NMR谱图所产生的信号为提取物信号，提取物间的共线性较低，且PLS-DA易于识别系统信息和噪音，可得到更好的分类效果。6类国标红木及2类混淆品红木的PLS-DA结果如图4所示。由于样本类别较多，使用三维图谱能更客观地反映分类模型的性能，因此，选择前3个主成分建立模型。PLS-DA的PC1、PC2和PC3分别为33%、28%和18%，累积贡献率达79%。由图4B可知，胶漆树组和染料紫檀组2类混淆品能与国标红木组进行良好地区分，除交趾黄檀组分别与奥氏黄檀组和檀香紫檀组间存在少量交集外，其余国标红木间都能得到很好地区分。因此，PLS-DA适用于红木的快速鉴别分析。

为探究红木PLS-DA模型的实用性，本研究从市场上搜集2个未知样本，信息如表1所示。将未知样本分别经“1.3”和“1.4”步骤处理后，所得结果如图5所示。未知样本X-1和X-2分别为从市场购得的未经鉴别的绒毛黄檀和交趾黄檀。由图5可知，样本X-1游离于识别模型的8个类别之外，证明其不属于本研究中的6类国标红木或2类混淆品类别；样本X-2在模型中被归入交趾黄檀组别中，与市场购入的标识组别相一致。因此，本研究基于PLS-DA构建的红木快速识别模型对未知样本也有较好的分类效果。

进一步分析PLS-DA模型所使用的PC1、PC2和PC3的组成，其前15个权重大的变量如图6所示。在δH1.18～1.26、δH3.70～3.90，δH6.66～6.70，δH6.74～6.82和δH6.86～6.90处各类样品间有较大的差异。根据文献可知[10,17]，红木的甲醇提取物中富含黄酮类成分，本实验中1H NMR谱图的特征峰与黄酮类化合物相符。因此，可初步判断δH1.18～1.26处为取代烷基上的H原子信号，δH3.70～3.90处为与苯基相连的取代氧甲基上的H原子信号，δH6.66～6.70、δH6.74～6.82和δH6.86～6.90处为与苯基直接相连的H原子信号。

在8类样本中，不同变量的最大表达和最小表达如图6所示。大果紫檀在δH1.18～1.26中具有最大的表达，即可认为在δH1.18～1.26处具有特征信号的化合物在大果紫檀组别中的含量应为最大。与此相反，巴里黄檀和奥氏黄檀分别在δH1.18～1.22、δH1.22～1.26中有最小的表达。由此可初步推断，δH1.18～1.26是区分大果紫檀和巴里黄檀、奥氏黄檀的主要特征区间。

交趾黄檀在δH3.70～3.74和δH3.86 ～3.90处具有最大的表达，刺猬紫檀在δH3.74～3.78处具有最大的表达，染料紫檀在δH3.78～3.86中具有最大的表达。与此相反，刺猬紫檀在δH3.70～3.74中具有最小的表达，胶漆树在δH3.74～3.90中具有最小的表达。由此可初步推断，δH3.74～3.90是区分混淆品胶漆树与其余组别的主要特征区间，而δH3.70～3.74是区分交趾黄檀与刺猬紫檀的主要特征区间。

染料紫檀在δH6.66～6.70中具有最大的表达，胶漆树在δH6.74～6.82中具有最大的表达，刺猬紫檀在δH6.86～6.90中具有最大的表达。与此相反，刺猬紫檀在δH6.66～6.70和δH6.74～6.82中有最小的表达，大果紫檀在δH6.86～6.90中具有最小的表达。由此可初步推断，δH6.66～6.70和δH6.74～6.82是区分混淆品染料紫檀、胶漆树与刺猬紫檀的主要特征区间，δH6.86～6.90是区分刺猬紫檀和大果紫檀的主要特征区间。

图4 6类国标红木及 2类混淆品PLS-DA分类结果的2D(A)和3D(B)图

3 结 论

本研究采用核磁共振技术和PLS-DA模式识别方法对8类共75批次的红木核磁共振氢谱数据进行处理，建立了核磁共振技术与模式识别方法相结合的红木快速鉴别新方法。结果表明，PLS-DA适用于红木的快速鉴别分析，能有效地区分国标红木及其混淆品，除交趾黄檀组分别与奥氏黄檀组和檀香紫檀组间存在少量交集外，其余国标红木均能得到很好地区分。该方法具有快速、灵敏度高、准确等优点，不受主观因素、环境和仪器的影响，是一种快速鉴别红木种类的可行之法。