DNA-Lipid探针用于细胞膜外pH值的原位成像

周文玉，汤娉婷，杨荣华2,，郑 晶*

(1.邵阳市环境保护监测站，湖南 邵阳 422000；2.长沙理工大学 化学与生物工程学院，湖南 长沙 410076；3.湖南大学 化学化工学院，湖南 长沙 410012)

细胞外pH值(Extracellular pH，pHe)在各种人体生理过程和化学反应中扮演着重要角色[1-2]，因此，对pHe进行检测具有重要的生理与病理意义，发展一种能够在缺氧环境下对细胞外pH值进行原位成像分析的方法尤为重要。目前缺氧环境下细胞外微环境pH值的检测鲜有报道。近年来，细胞膜表面固定化探针在再生医学和细胞生物学方面引起了人们的极大关注，但是这些固定化探针的构建经常涉及繁琐的固定修饰过程[3]、复杂的基因调控[4],或需要特定的亲和位点[5]，极大地限制了其实际应用范围和有效性。基于此，Tan课题组第一次合成了二酰基脂质体-DNA共轭物(DNA-lipid)[6-7]。二酰基脂质体(Lipid)是由两条分别含有18个碳的疏水烷烃组成的磷脂链，研究表明该共轭物可以二酰基脂质体为“尾巴”与细胞膜的磷脂双分子层之间发生强烈的疏水作用从而自发地组装到细胞膜表面[8-9]。此外，该共轭物还具有简单易行、生物相容性好以及细胞通用性等优点。i-motif结构是指胞嘧啶寡核苷酸链上的C∶C+碱基对在酸性环境下交替排列及互相嵌入而形成的四聚体结构[10]。

本文利用lipid可与细胞膜发生疏水相互作用，并结合i-motif结构在酸性环境下可对pH值产生快速、可逆响应的良好性质[11-13]，将两端标记Cy3和 Cy5的具有i-motif结构的DNA链作为一种比例型探针插入细胞膜表面，实现了细胞外pH值的检测。在常氧环境中，细胞膜外pH值处于中性，具有i-motif结构的DNA链两端的荧光基团处于分离状态，Cy3和 Cy5之间不发生荧光共振能量转移(FRET)效应。缺氧时，由于细胞内的糖酵解产生的大量乳酸改变了pH值的动态平衡，缺氧细胞上调细胞质膜的钠氢交换蛋白-1(NHE-1)等H+转运蛋白将H+排出细胞外，造成细胞外环境pH值降低。此时酸性的环境使i-motif结构发生变化形成四链体，序列两端的两个荧光基团相互靠近，Cy3(荧光供体)和 Cy5(荧光受体)之间发生强的FRET效应，可通过测定序列两端两种荧光基团荧光强度的比值实现常氧和缺氧环境中细胞膜外pH值的原位成像分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

流式细胞仪(贝克曼库尔特有限公司，美国)、激光共聚焦显微镜(奥林巴斯，日本)、荧光分光光度计(株式会社日立制作所，日本)；实验用水为Milli-Q(18.2 MΩ·cm)超纯水；所有试剂除特别说明外均为分析纯。所用DNA序列见表1。

表1 所用的DNA序列Table 1 DNA sequences used in this paper

1.2 溶液的配制

0.2 mol/L的磷酸(PB)缓冲液：分别配制0.2 mol/L Na2HPO4和0.2 mol/L NaH2PO4母液，高温灭菌后再将两者按不同比例混合，并调至所需pH值。

0.01 mol/L的磷酸盐(PBS)缓冲液(pH 7.4)：分别称取0.8 g NaCl，0.02 g KCl，0.362 g Na2HPO4·12H2O，0.024 g KH2PO4溶于80 mL水中，调节pH值为7.4，定容至100 mL，摇匀，静置，高温灭菌，冷却至室温，在4 ℃环境中保存。

1.3 探针的制备与表征

1.3.1探针的制备所用寡核苷酸序列均按照 1.0 μmol的规格在ABI 3 400 DNA合成仪上合成，合成的序列信息见表1。采用两步合成法[6]合成lipid，并利用DNA 合成仪将其自动偶联到寡核苷酸链的5’末端。序列合成后再按照指定程序对其进行脱保护处理，然后加入冷乙醇(相对DNA 2.5倍体积)和3 mol/L氯化钠(相对DNA 1/10 体积)进行沉淀，离心并收集DNA的沉淀物，再加入0.2 mol/L三乙基铵乙酸盐溶液将其溶解，以乙腈和0.2 mol/L三乙基铵乙酸盐溶液作为流动相，利用高效液相色谱仪进行分离纯化。分别用C4柱(200 mm×4.6 mm)和 C18柱(250 mm×4.6 mm)对常规寡核苷酸和标记了lipid的寡核苷酸进行纯化。通过紫外-可见分光光度计对纯化后的寡核苷酸产物进行测量并定量。

1.3.2细胞培养及细胞膜修饰实验用人宫颈癌细胞(HeLa)来源于杨荣华课题组细胞中心，细胞实验中所涉及的物品均经过滤除菌或高压灭菌处理。

在DMEM培养基中添加10%经热失活的胎牛血清和 0.5 mg/mL 青霉素-链霉素，并以此为细胞培养液进行HeLa细胞培养。在修饰细胞膜之前，先用4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液(50 mmol/L HEPES,pH 7.3,270 mmol/L 氯化钠)将细胞(2.5×105个)冲洗3次，然后加入DNA-lipid探针(1 μmol/L)置于室温(25 ℃)下孵育30 min。再把细胞清洗3次以除去未结合的探针，最后将细胞重新分散在180 μL HEPES 缓冲液中。

图1 DNA-lipid探针用于细胞外pH值检测的原理图

2 结果与讨论

2.1 检测原理

基于“FRET”效应的DNA-lipid探针对缺氧环境下细胞膜外pH值的传感检测原理如图1所示。首先在一条具有i-motif结构的DNA链两端分别标记Cy3和Cy5,再将这条序列的5’端连接疏水的lipid构成核酸探针DNA-lipid。在pH>7.0的环境下，该探针处于刚性状态，两端的荧光基团分离，未发生FRET；在pH<7.0的环境下，探针形成四聚体结构，Cy3(供体)和Cy5(受体)彼此靠近，荧光从供体转移至受体，发生FRET。利用lipid的性质将探针修饰在细胞膜表面，可以实现细胞膜外pH值的监测。常氧环境下，细胞外的pH值处于中性，i-motif结构不会发生弯曲；处于缺氧环境时，肿瘤细胞会通过上调细胞质膜上的H+转运蛋白将H+排出细胞外，从而造成细胞外环境呈酸性。酸性环境可使i-motif结构发生变化形成四链体，两个荧光基团相互靠近，发生FRET，Cy3的荧光减弱，Cy5的荧光增强，通过测定两者的荧光比值，可实现缺氧环境pH值的传感监测，从而促进肿瘤的早期诊断。

2.2 探针序列体外筛选及表征

本实验设计了如表1所示的5种不同的探针序列，并对其进行优化和表征。

2.2.1序列优化将S1～S5序列分别置于pH 5.0和pH 7.0的PB缓冲液中，在548 nm激发波长下，收集565 nm和666 nm处的荧光，并计算出每种序列在两种pH值环境下供体和受体的荧光比值，即RFA/FD(pH 7.0)/RFA/FD(pH 5.0)。结果显示S3序列对pH值的响应最好。因此，选定S3序列进行后续实验。

2.2.2序列表征用圆二色谱仪对S3序列的i-motif结构进行表征。结果显示：pH 7.0时，DNA链的正峰在270 nm左右，负峰在250 nm左右；当pH值降至5.0时，正峰红移至285 nm左右，而负峰红移至260 nm左右，该结果和文献报道一致[14-15]，进一步证实S3序列在酸性环境下生成了i-motif结构。

图2 DNA-lipid细胞表面固定前后流式细胞分析图

2.3 细胞膜表面传感器的构建及表征

本文以Tan等[8]报道的修饰方法将探针固定到细胞表面，并考察了DNA-lipid在细胞膜上的组装固定能力。以人的宫颈癌细胞(HeLa细胞)为模型细胞，在其上修饰lipid-S3-TAMAR(在S3的两端标记lipid和TAMAR)，孵育1 h后用细胞溶酶体tracker染料LysoTracker Green进行染色，然后用激光共聚焦显微镜进行成像。结果显示，LysoTracker Green的绿色荧光集中在溶酶体上，而羧基四甲基罗丹明(TAMAR)的红色荧光均集中在细胞的轮廓周围，表明探针已经成功地固定至细胞表面。为了进一步验证细胞表面的固定化，使用流式细胞仪对修饰后的细胞进行分析。结果如图2所示，细胞未经上述探针处理，只显示微弱的TAMAR荧光，探针处理1 h 后，细胞荧光信号明显增强，表明探针已经被很好地修饰到细胞膜表面。

2.4 体外标准工作曲线的绘制

本实验将探针溶于不同pH值的PB缓冲液中(pH 5.0～7.0)并测定其荧光变化，以考察探针在不同pH值环境下的工作情况，结果如图3所示。图3A为探针在不同的pH值下的FRET荧光光谱，并由此得到该探针的体外标准工作曲线(图3B)。从图3B可以看出，在pH值从7.5变化到5.0的过程中，FRET效应慢慢增强，FA/FD值扩大了近6倍(从0.3到1.8)。这一pH值检测区间与生理范围正好接近，由此说明该探针适用于细胞周围环境pH值的检测。pH值从5.0变化到7.0的过程中，FRET效应逐渐减弱，多次循环重复该实验，结果如图3B内插图所示，表明该实验重现性及可逆性好，可用于连续监测。

图4 不同pH值环境下HeLa细胞的共聚焦成像图

图5 不同氧气浓度程度下HeLa细胞的共聚焦成像图

2.5 细胞标准工作曲线

为了考察该探针在细胞膜表面对pH值的响应情况，本实验将修饰了探针的细胞先用PBS缓冲液清洗3次，除去游离的探针，然后置于不同的pHe环境中进行成像，并绘制了该探针在细胞表面的标准工作曲线。结果如图4所示，在pH值从7.0变化到5.0的过程中，随着pH值的降低，细胞表面红色荧光的强度逐渐增强，而绿色荧光的强度逐渐降低，表明该探针对细胞外的pH值有着很好的响应。同时，荧光比率成像的结果显示，该探针对pH值具有明显的依赖性。上述结果说明，本实验设计的这种基于“FRET”效应的比率型探针能有效地监测细胞外pH值的变化，有望进一步应用于缺氧环境下细胞膜外微环境的pH值成像分析。

2.6 不同氧气浓度环境下的细胞膜外pH值原位成像分析

将HeLa细胞和探针置于不同氧气浓度环境，用PBS缓冲液孵育1 h后放入培养再孵育1 h，用激光共聚焦显微镜分别对其成像，结果如图5所示。随着氧气浓度由20%(常氧)降至1%(全缺氧)，Cy3的荧光降低，而Cy5的荧光升高，并且FA/FD的比值呈规律性变化，结合细胞外pH值的标准工作曲线，得到在氧气浓度由20%将至1%时，细胞膜外的pH值由6.9降至6.2。

3 结 论

本研究首次发展了一种基于二酰基脂质的i-motif核酸探针用于原位成像分析不同氧气浓度下的细胞外pH值。该探针用FRET作为比率信号模式，能够降低复杂生物因素的影响，使细胞外pH值检测更精确。此外利用i-motif结构作为H+的识别单元，对pH值的响应灵敏度高且具有可逆性。该探针合成、操作简单，通用性良好。