基于磁性分子印迹修饰电极的氯霉素电化学发光分析法

张若鹏，康天放，鲁理平，程水源

(北京工业大学 区域大气复合污染防治北京市重点实验室，环境与能源工程学院，北京 100124)

氯霉素(CAP)属广谱抗生素，因其高效价廉而广泛应用于畜牧业生产中，但CAP可导致再生障碍性贫血和粒细胞缺乏症，对人类健康构成严重威胁。中国、欧盟、美国以及一些其他的国家已禁止在动物源性食物中使用CAP[1]。欧盟规定，肉、牛奶、蛋类、水产品等食物中的CAP最大残留量限值(Maximum residue limits)为0.3 μg/kg[2]。因此，建立痕量CAP的高灵敏度检测方法十分必要。目前，检测CAP的方法有高效液相色谱法(HPLC)[3]、液相色谱-质谱联用法(LC-MS/MS)[4]、表面增强拉曼散射法(SERS)[5]等。

分子印迹技术是近年迅速发展起来的一种制备具有特异性识别位点聚合物的新兴技术。首先，模板分子与功能单体在溶剂中形成稳定的模板-功能单体复合物，然后加入交联剂，形成具有一定强度的网状聚合物，最后采用适当的方法除去聚合物中的模板分子，在聚合物中留下了与模板分子大小、形状及作用位点相匹配的空穴，可对模板分子产生选择性识别作用[6-9]。分子印迹聚合物(Molecular imprinting polymer，MIP)具有高度交联的结构以及良好的稳定性，以MIP膜代替传统的生物分子用作识别元件，可制得选择性和灵敏度高、稳定性好、价格低廉的传感器[10]。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

2-丙烯酰胺-2-甲基丙基磺酸(AMPs)、对氨基苯硫酚(4-ATP)、氯霉素(CAP)、三丙胺(TPrA)、Ru(bpy)3Cl2·6H2O、二甲基丙烯酸乙二酯(EGDMA)、过硫酸铵(APS)、氯金酸(HAuCl4)、四乙氧基硅烷(TEOS)、3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES)购于北京百灵威科技有限公司；柠檬酸钠、FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、异丙醇、甲苯、三羟甲基氨基甲烷(Tris)购于北京化学试剂有限公司；氢氧化钠、乙醇、盐酸、乙酸购于天津福晨化学试剂有限公司；甲醇购于赛默飞世尔科技有限公司;上述所用试剂均为分析纯。实验用水为超纯水(Milli-Q Advantage A10 超纯水系统，法国Millipore公司)。

电化学发光实验在MPI-A型电化学发光分析仪(西安瑞迈电子有限公司)上进行，磁性玻碳电极(MGCE)直径3 mm，购自天津英科联合科技有限公司。以修饰的磁性玻碳电极(MGCE)作工作电极，Ag/AgCl(饱和KCl溶液)和Pt丝电极分别作参比电极和对电极。KQ218型超声波清洗仪、KQ-400KDE型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；JEM2011透射电子显微镜(JEOL公司)；UV-2450紫外可见吸收光谱仪、IR Prestige-21型红外吸收光谱分析仪(岛津公司)。

1.2 Fe3O4-Au磁性纳米粒子的制备

根据文献[11]制备金纳米粒子(AuNPs)，并略做修改：用移液枪将1.25 mL 20 g/L的氯金酸溶液移入100 mL水中，混匀，转移至清洁的三颈圆底烧瓶中，在水浴中将溶液加热至沸腾(整个过程持续搅拌)，逐滴加入12 mL 1%的柠檬酸三钠溶液，继续搅拌20 min，即得紫红色的AuNPs溶液。

根据文献[12-13]合成氨基功能化的Fe3O4磁性纳米粒子，并略做修改：取25 mL水至烧杯中通氮除氧，将5.2 g FeCl3·6H2O和2.0 g FeCl2·4H2O溶解于除氧后的水中，加入0.85 mL 浓盐酸，不断搅拌下升温至80 ℃，加入1.5 mol/L NaOH溶液，保持温度80 ℃，继续搅拌1 h，依次用乙醇、水清洗2次，用磁铁分离，干燥后即得到Fe3O4粉末。取0.2 g Fe3O4分散于150 mL乙醇中，在冰浴中连续超声15 min后，加入12 mL 28%的氨水和400 μL四乙氧基硅烷(TEOS)，继续在冰水浴中超声2 h，进行TEOS的水解反应。依次用乙醇、水清洗2次，用磁铁分离，干燥后即得到核壳型的Fe3O4@SiO2纳米粒子。取0.13 g Fe3O4@SiO2纳米粒子均匀分散于50 mL异丙醇中，加入1 mL 3-氨基丙基三乙氧基硅烷后，将该悬浊液加热至40 ℃,温和机械搅拌3 h。最后，将所得的黑色磁性纳米粒子用乙醇、水清洗，重复清洗3次，用磁铁分离，干燥后即得氨基功能化的纳米粒子Fe3O4@SiO2-NH2。

将0.10 g Fe3O4@SiO2-NH2纳米粒子均匀分散于13 mL 水中，加入8.0 mL AuNPs 悬浊液，在快速超声条件下混合机械搅拌8 h，用水洗涤4次，基于Fe3O4@SiO2-NH2带正电荷的质子化氨基与AuNPs表面带负电荷的柠檬酸根之间的静电吸引力作用,制得四氧化三铁-金纳米复合物，记作Fe3O4-Au。

1.3 Fe3O4-Au磁性纳米复合物表面制备CAP分子印迹膜(MIPs)

图1为CAP分子印迹传感器的构建过程示意图。参照文献[14-15]制备CAP分子印迹膜：首先，将上述制备的适量Fe3O4-Au纳米粒子加至含有20 mmol/L 4-ATP的甲苯溶液中，室温下自组装16 h后，用磁铁分离该悬浊液，将分离的纳米粒子加至含有10 mmol/L CAP的乙醇溶液中自组装4 h。随后将该悬浊液倒入三颈烧瓶中，依次加入0.083 g的AMPs、3 mL EGDMA、0.05 g APS，在35 ℃水浴中温和搅拌10 h。反应完成后将上述悬浊液用磁铁分离，用甲醇-乙酸(9∶1)混合溶液洗脱去除其中的CAP模板分子，最终得到覆盖于Fe3O4-Au磁性纳米粒子表面且对CAP具有专一识别性能的磁性分子印迹聚合物(MIPs)膜。用同样的方法制备磁性非印迹聚合物(NIPs)膜,制备过程中不加入CAP模板分子。

图1 CAP分子印迹电化学发光传感器的制备过程

1.4 电致化学发光检测方法

用0.05 μm的Al2O3粉末研磨抛光电极表面后，依次用无水乙醇、水、无水乙醇超声清洗，晾干备用。移取8.0 μL修饰了CAP分子印迹膜的Fe3O4-Au磁性纳米复合物，滴涂至磁性玻碳电极(MGCE)表面，以此为工作电极,将该电极置于不同浓度的CAP溶液中吸附CAP后，浸入含有8.0 μmol/L联吡啶钌和100 mmol/L三丙胺的Tris-HCl缓冲溶液(pH 7.4)中，直接测定发光强度，以空白溶液中的ECL强度I0与CAP溶液的ECL强度Ip的差值ΔI(=I0-Ip)作为ECL信号。电致化学发光实验参数设定为：扫描电位范围：0～1.6 V,扫描速率：100 mV/s,光电倍增管电压倍数：600 V,放大倍数：3级。

2 结果与讨论

2.1 Fe3O4-Au磁性纳米复合物的表征

图2为Fe3O4(A)、AuNPs(B)及Fe3O4-Au(C)的透射电镜(TEM)表征图。由图2A可知Fe3O4的粒径约为15 nm，从图2B可看出AuNPs的平均粒径约为10 nm,从图2C可清晰看到黑色球状的AuNPs粒子与形状不规则的Fe3O4粒子所构成的复合物Fe3O4-Au。

图3 Fe3O4-Au的能谱分析图

图3为Fe3O4-Au磁性纳米粒子的能谱分析图，由图可知主要物质成分为Fe、Au、O和Si元素，其均为Fe3O4-Au的主要元素，可以确证为Fe3O4-Au纳米复合物。其中高含量Cu元素的存在，主要是因为在能谱分析中采用铜网所致。

2.2 CAP分子印迹膜(MIPs)的表征

图4A、B分别为CAP的磁性分子印迹聚合物MIPs和磁性非印迹聚合物NIPs的扫描电镜(SEM)表征图，从图4可以看出MIPs表面褶皱且空隙多，这为CAP分子在磁性MIPs中的传输和再吸附提供了良好的通道，而NIPs表面较平滑且空隙较少。

图5 氯霉素磁性分子印迹聚合物的红外吸收谱图

图6 不同的电极在含有0.10mol/L TPrA和1.0×10-5mol/L三联吡啶钌的Tris-HCl(pH 7.4)缓冲液中的电化学发光图

2.3 传感器的电化学发光响应

2.4 实验条件的优化

表1 不同方法对CAP的检出限比较Table 1 Comparison of detection limits of different methods for determination of CAP

2.5 工作曲线

在上述优化条件下，考察了传感器在不同浓度CAP下的电化学发光响应，结果显示当修饰电极在CAP中吸附富集后，会产生猝灭效应，且随着CAP浓度的增高，猝灭效应增强。在0.010～100 ng/L浓度范围内，电化学发光的猝灭强度(ΔI)与CAP浓度的对数呈良好的线性关系，其线性方程为：ΔI=4 105.9+1 580.9×logc(r=0.998 0)，检出限(S/N=3)约为0.010 ng/L。将本方法的灵敏度与近年文献报道的CAP检测方法进行比较，由表1可见，本文提出的分子印迹传感器对CAP的检出限很低，完全可以满足水体中痕量CAP的检测需求。

2.6 传感器的重现性、稳定性与干扰实验

2.7 实际样品的检测

采用本文制备的CAP分子印迹传感器用于实际水样中CAP的检测。水样取自北京市丰台区凉水河，测定前用0.45 μm的滤膜过滤水样，将修饰了CAP分子印迹膜的磁性玻碳电极分别浸入原水样和加标水样中进行固相萃取吸附富集1.5 h，测定电化学发光信号，分别计算回收率和RSD。由表2可见，水样加标后所得结果与标准曲线所得结果基本一致，回收率为95.2%～105%，RSD为1.4%～3.2%。

表2 水样中CAP的检测Table 2 Determination of CAP in water ρ/(ng·L-1)

*：no detected

3 结 论