牛奶中32种农药的气相色谱-离子阱串联质谱法测定

陈美瑜,林竹光

(1.厦门大学 材料学院，高性能陶瓷纤维教育部重点实验室，福建 厦门 361005；2.厦门大学 化学化工学院 化学系，福建 厦门 361005)

随着人们生活水平和保健意识的提升，牛奶作为补钙的最佳途径之一备受欢迎。牛奶在食物营养链中处于较高级，其含有的农药残留量相对较高，长期食用被农药污染的牛奶能致畸、致癌、致突变，对人体健康危害较大[1]。因此，建立一种准确、灵敏的分析方法来监测牛奶中的农药残留十分必要。测定牛奶中农药残留常用的分析方法有气相色谱法[2-3]、液相色谱法[4]、气相色谱-质谱法[5-6]、气相色谱-串联质谱法[7-8]、液相色谱-质谱法[9-10]等。其中串联质谱法以“时间串联”质谱的方式，使用二级质谱技术选择适合的母离子进行二级质谱分析，排除了背景与基质干扰，具有定性准确、灵敏度高且成本低廉的特点，已在环境[11-12]和生物[13-15]分析等领域得到广泛应用。

本文在前期研究基础上[16]，建立了GC-IT-MS/MS同时测定牛奶中32种农药残留的分析方法。本方法操作简单、抗干扰能力强，适用于目标化合物含量低、基质背景复杂的牛奶样品分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Varian Saturn 2100T GC/MS/MS系统，配备3900气相色谱和EI与CI两种电离源；KQ 3200E超声波清洗器(江苏昆山市超声仪器有限公司)；DK-S22型电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司)；自制的氮吹浓缩装置。

乙腈、正己烷、丙酮(农残级，美国Tedia公司)；中性氧化铝(200～300目)、无水Na2SO4(分析纯，国药集团股份有限公司)；灭线磷、甲拌磷、二嗪磷、乙拌磷、甲基毒死蜱、甲基对硫磷、皮蝇磷、杀螟硫磷、毒死蜱、倍硫磷、对硫磷、溴硫磷、乙硫磷、α-BHC、β-BHC、γ-BHC、δ-BHC、艾氏剂、环氧七氯、狄氏剂、异狄氏剂、p,p’-DDE、p,p’-DDD、p,p’-DDT、联苯菊酯、三氟氯氰菊酯、氯菊酯、氯氰菊酯、氰戊菊酯、氟胺氰菊酯、溴氰菊酯(中国农业部环境保护科研监测所)；氟氯氰菊酯、内标物PCB 103(美国Accu Standard Inc.)。

1.2 GC-MS/MS分析条件

GC分析条件：HP-5 MS毛细管柱(30 m×0.25 mm i.d.，0.25 μm)；He载气(>99.999%)；载气流速：1.00 mL/min；不分流进样1.00 μL(均采用自动进样器)；进样口260 ℃。色谱柱升温程序：从80 ℃ 以25 ℃/min升至250 ℃，然后以2 ℃/min升至260 ℃，并保持15 min。

MS/MS分析条件：阱温200 ℃；阱外套40 ℃；传输线280 ℃；电子倍增管电压1 550 V；电子倍增管增益电压200 V；电离能量70 eV；CI采用甲醇作为反应气；所有化合物均采用共振激活裂解方式。

1.3 标准溶液的配制

标准储备溶液：将13种有机磷农药标准溶液用丙酮稀释成10.0 mg/L的储备液，将11种有机氯农药标准溶液、8种拟除虫菊酯农药标准溶液和内标物用正己烷稀释成10.0 mg/L的储备液，于4 ℃保存,有效期1年。

混合标准溶液：取适量32种农药储备液，用正己烷-丙酮(1∶1，体积比)稀释成32种农药的混合标准溶液，其中有机磷类和拟除虫菊酯类农药的质量浓度分别为25、50、100、200、500 μg/L，有机氯类农药的质量浓度分别为10、20、50、100、200 μg/L，内标物PCB 103的质量浓度为10 μg/L。

1.4 样品前处理方法

准确称取3.0 g牛奶于100 mL锥形瓶中，加入3.0 g 200～300目的中性氧化铝及适量的无水硫酸钠，充分搅匀至半湿状态。以15.0 mL乙腈超声提取15 min，提取液经快速定量滤纸过滤；残渣再用10.0 mL乙腈超声提取10 min，过滤后合并2次滤液，置于50 ℃恒温水浴中氮吹浓缩至干，用正己烷-丙酮(1∶1)将其溶解并转移至带刻度的2.0 mL测试瓶，加入0.4 mL 25 μg/L PCB 103(IS)，定容至1.0 mL，待分析。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件

前处理方法参照本课题组的前期研究成果[16]，采用改进的基质固相分散方法，用乙腈作为提取剂。实验发现，32种农药的平均加标回收率为71.5%～116%，方法的回收率能满足痕量农药残留的分析要求。

2.2 色谱升温程序

色谱柱升温程序的设定，原则上既要保证目标物的完全分离，又要尽量缩短分析时间。但多农残分析对色谱柱的要求极高，且每个目标物均设定一个流出时间段，将使分析时间过长，不利于多残留的分析。GC-MS/MS对于多残留分析中无法完全分离的目标物，提供了多反应监测(MRM)的方式，可同时开设5个不同的离子通道，运用不同的MS/MS分析条件在同一时间段对5种不同目标物进行准确的定性定量分析。32种农药的分离时间见表1。

表1 32种农药和内标物的MS/MS质谱参数Table 1 GC-IT-MS/MS parameters for 32 pesticides and internal standard

*quantitation ion

2.3 MS/MS条件的优选

在离子阱中，高浓度的目标物可能会使质谱谱图变形，且高浓度目标物优化后的MS/MS条件不一定适合于低浓度同种目标物的分析，因而在确定MS/MS分析条件时，选择中等浓度的32种混合标准样品(200 μg/L，其中有机氯农药为100 μg/L)优化MS/MS分析条件。

图1 32种农药混合标准溶液的总离子流图

图2 乙硫磷在不同阱温下的GC-MS/MS谱图

图3 灭线磷在不同总离子数下的GC-MS/MS谱图

2.3.1母离子的选择MS/MS分析包括两个过程：母离子的选择和子离子的形成。目标物或内标物进入离子阱，被解离为离子碎片，选择丰度高、质荷比大的离子作为母离子。采用合适的碰撞能量使母离子解离，再选择合适的子离子进行定量分析。图1为GC-MS/MS分析32种农药混合标准溶液的总离子流图(TIC) 。从图中可以看出，采用GC-MS/MS进行分析时，样品基质和柱流失的干扰小，农药的分析灵敏度较高。

2.3.2共振分析的碰撞诱导解离电压离子阱中母离子裂解的方式包括共振裂解和非共振裂解。试验过程中发现采用非共振裂解方式时母离子裂解的能力较弱，本实验在共振裂解方式下优选碰撞诱导解离(CID)电压。结果表明，当CID电压大于1 V时，大多数目标物被裂解为质荷比较低的子离子，因而CID电压选择0～1 V。合适的CID电压应使MS/MS谱图中保有适量的母离子及合适丰度的子离子。32种目标物的CID电压优化结果见表1。

2.3.3离子阱温度的选择离子阱在低温时对极性较弱的目标物或干扰物的离子具有吸附作用并阻碍离子从离子阱中抛出。由图2可知，当阱温为180 ℃时，乙硫磷的GC-MS/MS色谱峰有严重的拖尾现象；当阱温升至200 ℃时，峰拖尾现象明显改善；当阱温为220 ℃时，离子流强度值下降，原因可能是高温使离子碎片部分裂解。因此，本文采用200 ℃作为离子阱的分析温度。

2.3.4离子源和反应气总离子数的选择化学电离(CI)源是通过在反应过程中引入反应气，灯丝发出的电子先将反应气电离，然后反应气离子与样品分子进行离子-分子反应，使目标物形成多1个氢离子的准分子离子。CI源的应用使得MS/MS法可以分析一些分子量较小或稳定性较差的不适于EI源分析的化合物。32种农药的离子源方式见表1，除稳定性较差的灭线磷、乙拌磷、甲基毒死蜱、甲基对硫磷、杀螟硫磷、毒死蜱、倍硫磷、对硫磷和氟氯氰菊酯使用CI源以外，其余的23种农药均采用EI源。

本实验选择甲醇作为CI的反应气并优化其总离子数。图3是灭线磷在不同离子数下的GC-CI-MS/MS谱图，从图中可以看出，当离子数较低(675 counts)时，峰响应值较低，信噪比低；当离子数较高(1 275 counts)时，峰响应值虽高，但背景响应值也升高，使信噪比较低。而选择875 counts作为反应气的总离子数，可使分析的信噪比最高，且能达到较理想的分析结果。

2.3.5其他MS/MS参数由于离子化时间越长，目标物的离子化程度越充分，分析的灵敏度越高，故本实验采用最大离子化时间25 ms(EI)、2 000 μs(CI)。实验发现其余参数对分析灵敏度的影响不大，故采用仪器的缺省值：预扫描时间1 500 μs(EI)，100 μs(CI)；离子阱离子浓度AGC目标值为5 000；离子分离窗口m/z为5。

2.4 线性关系及方法检出限

在优化后的色谱-质谱条件下分别采集“1.3”配制的不同浓度32种农药和内标物的GC-MS/MS色谱图，分别以目标物与内标物定量离子的峰面积比(y)对目标物与内标物的浓度比(x)作线性分析，得到的线性范围和相关系数(r)见表2。结果表明,32种农药在测试浓度范围内均呈现良好的线性关系，相关系数均大于0.994。

按取样量1.00 g 、定容体积 1.00 mL 、 进样体积 1.00 μL和信噪比S/N≥3计算，得到各农药的方法检出限(MDL)见表2。结果表明,除倍硫磷和毒死蜱的MDL分别为1.7、2.8 μg/kg，其它30种农药的MDL为0.026～1.2 μg/kg。

表2 32种农药和内标物的线性范围、相关系数(r)、检出限(MDL)、平均回收率及相对标准偏差Table 2 Linear ranges,correlation coefficients(r),method detection limits(MDL)，mean recoveries and RSDs for 32 pesticides and internal standard

2.5 加标回收率与相对标准偏差

称取3.0 g牛奶空白样品(32种农药残留均小于MDL)分别添加相当于牛奶样品含50、200 μg/kg浓度水平的32种农药混合标准溶液(有机氯类农药的加标浓度水平分别为20、100 μg/kg)，按实验步骤进行分析(n=5)，各农药的平均加标回收率和相对标准偏差(RSD)见表2。从表中可以看出，各农药的平均加标回收率为71.5%～116%，RSD为1.9%～14%。方法的准确度与精密度符合痕量农药残留的分析要求。

2.6 方法的选择性

采用裂解母离子产生的特征子离子对目标物进行定性与定量分析，不易受基体的干扰，因而GC-MS/MS分析结果灵敏度和可靠性更高。图4A、B分别为100 μg/L毒死蜱标准溶液和加标100 μg/L毒死蜱的牛奶提取液的MS/MS谱图，两图无明显差别，可看出该方法消除基体干扰的能力极强，基本不出现基体背景产生的干扰信号。

2.7 实际样品的检测

将本方法应用于多种品牌10个牛奶样品的分析(样品购于当地大型超市)，在纯牛奶和花生牛奶中检出p,p’-DDT、氯氰菊酯和氰戊菊酯，其含量分别为5.1～18.6 μg/kg、5.9～15.1 μg/kg和4.8～9.8 μg/kg，均低于GB2763-2016《食品中农药最大残留限量》规定的最大残留限量[17]。

3 结 论

本文建立了GC-IT-MS/MS同时测定牛奶中32种农药的分析方法，并系统研究了离子阱串联质谱参数对目标化合物检测结果的影响。通过优化母离子和子离子、CID电压、离子源温度、EI/CI电离源、反应气的总离子数、离子化时间、预扫描时间、AGC目标值、离子分离窗口，确定了最佳质谱条件。该方法无需净化处理、抗干扰能力强、灵敏度高、选择性好，方法检出限为0.026～2.8 μg/kg，实际样品的加标回收率为71.5%～116%，相对标准偏差为1.9%～14%，可满足脂肪含量高、基体复杂的牛奶中痕量农药多残留的快速检测。