荔枝与龙眼中噻虫啉、螺虫乙酯及代谢物的高效液相色谱-串联质谱分析

王思威，曾广丰，刘艳萍，王潇楠，孙海滨*

(1.广东省农业科学院植物保护研究所 广东省植物保护新技术重点实验室，广东 广州 510640；2.广东检验检疫技术中心，广东 广州 510623)

荔枝(LitchichinensisSonn.)和龙眼(DimocarpuslonganLour.)均为无患子科植物，属亚热带地区重要的常绿果树，主要产于广东、广西、福建等地[1-4]。荔枝含有丰富的维生素C、维生素E、多糖、类黄酮等成分；龙眼具有补血益气、安神养心之功效，含有糖类、维生素、酚类、多糖等成分[1-4]。南方高温的气候特点使得荔枝、龙眼树的虫害严重，而烟碱类杀虫剂噻虫啉和季酮酸类杀虫剂螺虫乙酯因具有较强的内吸作用，对荔枝、龙眼树的蓟马、螨类等刺吸式口器害虫具有良好防效。其中，螺虫乙酯因具有双向内吸传导的独特性能，使其可在植物体内移动，抵达叶面和树皮，有效阻止害虫的卵和幼虫的生长发育，增强防治效果。螺虫乙酯在植物体内的降解产物主要有BYI08330-烯醇糖苷(B-glu)、BYI08330-醇酮(B-keto)、BYI08330-烯醇(B-enol)、BYI08330-羟基(B-mono)4种。噻虫啉对蜜蜂群落有显著影响(荔枝、龙眼主要靠蜜蜂传粉)，且可增加肝脏肿瘤发病率[5]；螺虫乙酯及代谢物可引起动物和人的眼部刺激和潜在皮肤过敏效应，且对地下水的潜在影响未知[6]。通过建立荔枝和龙眼中螺虫乙酯和噻虫啉的分析方法，可为后续对荔枝和龙眼中2种杀虫剂的膳食摄入风险评估及对蜜蜂的风险评价提供研究基础。当前噻虫啉和螺虫乙酯及代谢物残留测定的研究主要集中于番茄、菠菜、柑橘等，暂未发现荔枝和龙眼中的相关报道。

目前，关于噻虫啉的检测方法主要有液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱法(LC-MS/MS)[7-11]，前处理方法主要有液液分配、QuEChERS净化、弗罗里硅土填充柱或固相萃取柱净化，定量下限为0.01～0.05 mg/kg[12-15]。螺虫乙酯的检测方法有HPLC法、气相色谱-质谱法(GC-MS)和LC-MS/MS法，其代谢物均采用液质联用分析法；前处理方法包括液液分配萃取、固相萃取(SPE)、分子印迹和QuEChERS净化等[16-22],定量下限为0.005～0.05 mg/kg[23-26]。但液液分配萃取、填充柱净化等前处理方法的有机溶剂用量大，且操作繁琐，费时费力；固相萃取和分子印迹技术的成本较高。QuEChERS法的独特优势(快速、简便、通用性强)使其对水果、蔬菜等基质中的净化效果十分突出[27-29]。本研究以荔枝和龙眼为研究对象，建立了噻虫啉、螺虫乙酯及代谢物的QuEChERS/高效液相色谱-串联质谱分析方法，为不同水果中噻虫啉、螺虫乙酯及其代谢物残留的同时检测提供了简便、快速、精准的新方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

AB SCIEX 4000Q 三重四极杆质谱仪，配电喷雾离子源(ESI)(美国AB SCIEX公司)；Agilent LC-1200高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司)；GTR22-1离心机(北京时代北利离心机有限公司)；OA-SYS氮吹仪(美国Organomation Associates公司)；XW-80A涡旋仪(上海精科有限公司)。

乙腈(色谱纯，美国Fisher公司)；甲酸(色谱纯，美国Fluka公司)；无水硫酸镁、氯化钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；十八烷基键合硅胶(C18)、N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化碳黑(GCB)吸附剂(上海安谱实验科技股份有限公司)。标准品：噻虫啉(纯度99.0%，美国Chem Service公司)；螺虫乙酯及代谢物B-glu、B-keto、B-enol、B-mono的纯度分别为99.2%、89.6%、92.8%、99.8% 和98.2%(德国Ehrenstorfer GmbH)。

1.2 标准溶液的配制

标准储备溶液：分别准确称取适量噻虫啉、螺虫乙酯及4种代谢物标准品，用乙腈配制成1 000 mg/L的标准储备溶液，于4 ℃避光保存，待用。

混合标准溶液：分别准确吸取1 mL噻虫啉、螺虫乙酯及4种代谢物的标准储备溶液于同一10 mL容量瓶中，用乙腈定容至10 mL，配制成100 mg/L的混合标准溶液。

1.3 样品前处理

准确称取荔枝、龙眼样品5.0 g(精确至0.01 g)，置于50 mL离心管中，加入10 mL乙腈进行提取，以10 000 r/min 匀质1 min后，加入2 g无水硫酸镁和1 g氯化钠，剧烈振荡，涡旋1 min，再以5 000 r/min离心2 min。取2 mL乙腈层溶液，置于装有0.3 g无水硫酸镁、0.025 g C18和0.025 g GCB的离心管中，剧烈振荡，涡旋10 s，再以10 000 r/min离心2 min。取上清液过0.22 μm有机滤膜，待测定。

1.4 色谱-质谱条件

色谱条件：Poroshell-120 EC-C18柱(150 mm×3.0 mm,2.7 μm)；柱温为35 ℃；流动相为0.1%(体积分数)甲酸水溶液-乙腈(体积比25∶75)，等度洗脱5 min；流速为0.4 mL/min；进样量为5 μL。

质谱条件：离子源为ESI+；扫描模式为多反应监测模式(MRM)；离子源温度为550 ℃；气帘气压力为0.2 MPa；毛细管电压为5 500 V；雾化气压力为0.3 MPa；加热辅助气压力为0.3 MPa。其他质谱参数见表1。

表1 噻虫啉、螺虫乙酯及代谢物的质谱参数与保留时间Table 1 Mass spectra parameters and retention times of thiacloprid,spirotetramat and its four metabolites

*quantitative ion

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

2.1.1提取溶剂的选择考察了乙酸乙酯、乙腈和乙腈-乙酸乙酯(体积比1∶1)作为提取溶剂时对6种目标化合物的提取效率。结果显示，以乙腈为提取溶剂时，6种目标农药的提取率为80.7%～103%；以乙酸乙酯为提取溶剂时，B-enol的回收率仅为13%；而乙腈-乙酸乙酯(1∶1)为提取溶剂时，B-enol的回收率为3.3%。这可能是由于乙酸乙酯溶于水，导致其不能从基质中完全提取极性较强的B-enol。因此，最终选择乙腈作为提取溶剂。

2.1.2吸附剂的选择实验考察了QuEChERS前处理方法的常用吸附剂(PSA、C18、GCB、PSA+C18、PSA+GCB、C18+GCB)对噻虫啉、螺虫乙酯及4种代谢物的吸附效果。结果显示：PSA吸附剂对B-enol和B-glu的回收率较低(25.6%～40.8%)；PSA+C18组合对B-enol和B-glu的回收率极低(15.0%～24.3%)；PSA+GCB组合对B-glu的回收率较低(30.2%～34.4%)；采用C18、GCB或C18+GCB组合对上述6种化合物的回收率均在80%以上。C18吸附剂是硅胶基质键合十八烷基填料，其比表面积大，吸附能力较强，能够去除脂肪、脂类等非极性干扰物；GCB可显著去除样品中的色素。由于荔枝和龙眼样品中的色素、糖类等物质较多，采用单一吸附剂不能有效去除杂质，因此本研究选用0.025 g C18+0.025 g GCB吸附剂组合，可使噻虫啉、螺虫乙酯及4种代谢物获得良好的吸附效果及回收率。

图1 Poroshell-120 EC-C18色谱柱对噻虫啉、螺虫乙酯及代谢物的分离色谱图

2.2 色谱柱的选择

在乙腈-0.1%甲酸流动相体系下，比较了Poroshell-120 EC-C18(150 mm×3.0 mm,2.7 μm)、XBridge C18(100 mm×2.1 mm，3.5 μm)、Atlantis T3 C18(100 mm×3.0 mm，3.0 μm) 3种色谱柱对6种目标物的分离效果。结果显示：Poroshell-120 EC-C18柱对目标物的分离效果略好，峰形对称(图1)；XBridge C18柱对目标物的分离度较差；Atlantis T3 C18柱对目标物分离的峰形不对称，产生了拖尾现象，影响定量结果。综上，选择Poroshell-120 EC-C18作为本研究的色谱分离柱。

2.3 流动相的选择

考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液4种流动相体系对目标化合物的分离度及响应强度。结果显示：以甲醇为有机相时，B-glu的峰形不对称、峰展宽，影响定量结果。而以乙腈为有机相时，在水相中加入0.1%甲酸可以促进[M+H]+离子峰形成，提高目标农药检测的灵敏度。因此，流动相选用乙腈-0.1%甲酸水溶液。

2.4 质谱条件的优化

考察了正负离子扫描模式对6种目标化合物的离子化效果，发现目标物在正离子模式下响应更高，为提高目标化合物的离子化效率，对源内参数进行了优化。在正离子模式下，采用针泵进样的方式对化合物进行全扫描，通过一级质谱扫描获取稳定的[M+H]+分子离子，确定母离子后，在MRM模式下对化合物的去簇电压(DP)进行优化；在二级质谱中，母离子发生断裂或重排等裂解反应，产生不同的m/z离子碎片，选择响应最高且干扰最少的2个碎片离子为定性和定量离子，分别优化其碰撞能量(CE)。优化后的质谱条件如“1.4”所示，二级质谱图见图2。

2.5 基质效应

采用HPLC-MS/MS分析样品时，基质效应(ME)是影响定量结果准确性的重要因素。本实验采用下式计算基质效应：ME(%)=[(mmatrix/msolvent)- 1)]× 100%，其中mmatrix为基质匹配标准曲线的斜率，msolvent为纯溶剂标准曲线的斜率。当ME为正值时，表示存在基质增强效应；ME为负值时，表示存在基质抑制效应；ME=0时，表示不存在基质效应。实验结果表明(表2)，噻虫啉、螺虫乙酯及其4种代谢物在荔枝和龙眼中的ME均为负值，表现为基质抑制作用，其中B-keto在荔枝和龙眼中的基质效应绝对值低于47%，其它化合物的基质效应绝对值为75.3%～96.7%，表明B-keto的基质抑制效应相对较强，其它化合物则相对较弱。本实验采用基质匹配标准溶液校正基质效应，从而确保实验结果的准确性和可靠性。

表2 噻虫啉、螺虫乙酯及代谢物的检出限、定量下限、回收率、相对标准偏差及基质效应Table 2 LODs，LOQs,recoveries,RSDs and matrix effects of thiacloprid,spirotetramat and its four metabolites in litchi and longan samples

(续表2)

CompoundSampleLOD(μg/kg)LOQ(μg/kg)Spiked(μg/kg)Recovery(%)RSD(%,n=5)Matrix effect(%)Longan0.31.01,10,10080.4,90.1,97.53.1,4.7,2.6-96.4B-ketoLitchi0.31.51,10,10082.0,88.3,98.22.9,5.6,2.5-40.8Longan0.31.51,10,10085.9,90.3,97.05.8,4.2,4.9-46.9B-enolLitchi0.10.31,10,10080.5,91.3,94.02.4,4.7,6.0-75.3Longan0.20.71,10,10082.1,88.6,98.03.2,4.2,5.0-88.7B-monoLitchi0.31.01,10,10080.9,89.9,99.41.4,3.7,4.5-90.7Longan0.31.01,10,10085.6,96.3,97.55.4,5.4,3.6-94.4

2.6 方法学评价

2.6.1线性范围、检出限与定量下限在1～500 μg/L范围内，以基质匹配标准溶液的质量浓度(x,μg/L)为横坐标，对应的响应值(y)为纵坐标作图，经最小二乘法得噻虫啉、螺虫乙酯及4种代谢物的线性方程。结果显示，6种目标物的线性关系良好，相关系数(r2)均大于0.990。分别以3倍和10倍信噪比(S/N)确定方法的检出限(LOD)和定量下限(LOQ)。由表2可知，本方法对噻虫啉的LOD和LOQ分别为0.03～0.06 μg/kg和0.1～0.2 μg/kg，均低于烟草[9](0.5 μg/kg和0.16 μg/kg)和花生[14](1～5 μg/kg)中的报道值；对螺虫乙酯及其4种代谢物的LOD和LOQ分别为0.1～0.3 μg/kg和0.3～1.5 μg/kg，均低于动物源食品[21](10～50 μg/kg，30～300 μg/kg)、牛奶[12](0.125～0.75 μg/kg，0.425～2.5 μg/kg)和番茄[15](LOD为0.03～1.6 μg/kg)等基质中的报道值。

2.6.2回收率与相对标准偏差在荔枝和龙眼空白样品中添加1、10、100 μg/kg 3个浓度水平的6种目标物混合标准溶液，每个加标水平重复5次，并作空白对照。6种目标物在荔枝和龙眼中的平均加标回收率为80.4%～99.5%，相对标准偏差(RSD)为1.4%～6.4%(表2)。荔枝空白样品加标的色谱图见图3。本方法具有较高的回收率和良好的精密度，可满足荔枝和龙眼样品中噻虫啉、螺虫乙酯及4种代谢物的检测要求。

2.7 方法的应用

采用本方法对市场中随机购买的20份荔枝和龙眼样品进行检测，均未检出噻虫啉、螺虫乙酯及4种代谢物的残留。

3 结 论

本文在对样品前处理和仪器分析条件优化的基础上，建立了测定荔枝和龙眼中噻虫啉、螺虫乙酯及4种代谢物残留的HPLC-MS/MS方法。应用优化的QuEChERS方法进行样品前处理，操作简便、可靠，方法检出限为0.03～0.3 μg/kg，定量下限为0.1～1.5 μg/kg。荔枝和龙眼中噻虫啉、螺虫乙酯及4种代谢物在1、10、100 μg/kg水平下的平均加标回收率为80.4%～99.5%，RSD为1.4%～6.4%。本方法可用于荔枝和龙眼等水果中噻虫啉、螺虫乙酯及代谢物的定性定量分析。