大鼠急性脑梗死后肾功能的动态观测

曹香玲，吴新贵，张俊川，周丽芳，刘建伟

缺血性卒中不仅造成大脑神经功能缺损，还能造成其他系统严重的并发症。研究表明，缺血性卒中常会继发心脏、肾脏等脏器损害[1,2]，引起心肌组织出血、缺血、肾脏组织肿胀变性及低灌注性损伤[3,4]。在脑梗死临床治疗中，更多的集中在减轻脑损伤及神经功能缺损康复方面，而针对其它脑梗死并发症特别是肾损伤的重视程度、治疗和研究较少，因此在促进脑梗死患者神经功能恢复的同时，针对其并发症的治疗也十分重要，这直接影响到患者受损神经功能的近期及远期恢复。本实验通过观察急性脑梗死大鼠不同时间点肾脏形态和功能结构的改变，了解急性脑梗死对肾脏的影响，为卒中后继发肾损伤的治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 挑选SPF级健康雄性SD大鼠48只，平均体重(270±50)g，由广西医科大学实验动物中心提供，动物生产许可证号：SCXK桂2014-0002。实验动物使用许可证号：SYXK(桂)2014-0003。实验前12 h禁食不禁水。采用随机数字表法将大鼠分为假手术组、模型组，每组再随机分为1 d、3 d、7 d、14 d 4个亚组，每个亚组6只。

1.2 方 法

1.2.1 建立脑梗死模型 模型组采用改良Longa线栓法[5]，制备右侧大脑中动脉梗死(MCAO)大鼠模型。以10%腹腔注射(35 mg/kg剂量)麻醉大鼠，将大鼠仰卧固定，颈部消毒后正中切开，钝性分离暴露右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ICA)、颈内动脉(ECA)，在血管下方分别放置丝线并用止血钳固定，以悬挂丝线的方式三方反向牵引，暂时阻断CCA、ICA、ECA血流，在距ICA分叉5 mm处，用微型眼科剪剪开CCA上1/3动脉壁，插入线栓，沿ICA向上平行推进(19±0.5)mm，结扎ICA，并于血管剪开口处前后结扎CCA以固定线栓、止血，消毒后逐层缝合切口。假手术组大鼠只分离右侧CCA、ICA、ECA，不插线栓不结扎，消毒后缝合切口。术中及术后注意大鼠保温。

1.2.2 模型纳入标准 急性MCAO大鼠模型制备参考Bederson 4分5级法[6]在大鼠手术苏醒后24 h内，出现以下任意两项即为造模成功：(1)左侧肢体疼痛刺激后收缩现象消失；(2)向左倾倒或转圈；(3)提尾时左上肢屈曲抱胸，不能向前伸直。

1.2.3 标本采集 两组大鼠分别在1 d、3 d、7 d、14 d 4个时间点随机选取6只，麻醉成功后仰卧固定，将大鼠沿腹部正中线由会阴上方至膈肌剪开，完全暴露腹部脏器，快速找到腹主动脉，采集腹主动脉血4 ml，室温下静置2 h后，4 ℃ 3000/min离心10 min取上清液，全自动生化分析仪常规测定Cr、BUN、Cys C含量；放血处死大鼠后，剪去左肾组织，生理盐水清洗血渍，放入4%多聚甲醛溶液中固定24 h，常规石蜡包埋、切片，HE、Masson染色，光学显微镜下观察肾脏结构形态的改变。

2 结 果

2.1 大鼠急性脑梗死模型评价 模型组大鼠术后第一天精神烦躁，原地追尾转圈，随着时间延长，大鼠右侧瞳孔缩小、眼睑下垂、眼球内陷，甚至少量血渍，出现Honer症；精神逐渐变差，萎靡，倦怠，活动减少，行动迟缓，弓背滞伏，进食、进水、排尿减少，大便质硬干结，量少；皮毛色泽晦暗、易掉毛，体型逐渐消瘦，术后6 d～7 d时，大鼠体重不再下降，精神较前稍好转，少量进食，但仍活动较少，身体易左侧倾倒。假手术组大鼠未出现上述神经缺损症状，摄水饮食正常，可排除脑梗死。

2.2 大鼠肾组织病理学改变 肉眼观察，假手术组大鼠的肾脏形态及大小正常，颜色润泽；模型组大鼠，1 d、3 d时肾脏肿胀，色泽暗红，7 d及14 d时部分大鼠肾脏组织体积缩小，颜色暗红，肾脏表面散在少量出血点。

2.2.1 HE染色 假手术组大鼠肾组织切片各时间段结构清晰，无细胞肿胀、充血，肾小管管腔完整，肾小球形态正常；模型组第一天、第3天肾组织的病理变化不明显，偶见肾小管上皮细胞肿胀，肾小球未见明显改变，第7天、第14天镜下可见部分肾小管上皮细胞出现水肿、空泡化、刷状缘消失，部分肾小球出现萎缩(见图1)。

A：假手术组；B：模型组3 d；C：模型组7 d；D：模型组14 d图1 各组大鼠术后1 d、3 d、7 d、14 d时肾组织HE染色(×200)

2.2.2 Masson染色 假手术组1 d、3 d、7 d、14 d各切片结构清晰，肾小管胞质、红细胞呈暗红色；模型组第一天、第3天肾组织未见明显病理变化，第7天、14天镜下可见部分肾小管上皮细胞附近出现绿色淡染，表明肾小管间质出现少量胶原纤维(见图2)。

A：假手术组；B：模型组3 d；C：模型组7 d；D：模型组14 d图2 各组大鼠术后1 d、3 d、7 d、14 d时肾组织Masson染色(×200)

2.3 大鼠血中Cr、BUN、Cys C浓度变化 大鼠脑梗死后1 d血清中Cr、BUN浓度有升高，但与假手术组(A组)比差异不显著(P>0.05);而脑梗死后3 d、7 d、14 d时Cr、BUN浓度明显升高,与假手术对照组比较差异有统计学意义(P<0.05)。模型组(B组)内Cr浓度术后14 d和1 d、3 d、7 d比较，差异有统计学意义(P<0.05);模型组内BUN浓度术后7 d和1 d、3 d、14 d比较，差异有统计学意义(P<0.05)；血清Cys C含量在脑梗死术后3 d明显升高，差异有统计学意义(P<0.05);模型组内Cys C术后3 d和1 d、7 d、14 d比较差异有统计学意义(P<0.05)，提示大鼠急性脑梗死后肾功能受损(见表1)。

表1 各时间点大鼠血清Cr、BUN、Cys C浓度变化

与假手术组相比*P>0.05；与假手术组相比#P<0.05

3 讨 论

急性脑梗死(acute cerebral infarction，ACI)可诱发多系统并发症，急性肾损伤是常见并发症之一，脑梗死急性期伴发肾脏高灌注，损害肾小球基底膜，尿蛋白增多，随着肾小球滤过率下降，肾功能指标血清UA、Cr、BUN、CysC水平升高[7～9]。肾损伤后导致的水钠代谢紊乱、酸中毒及氮质代谢产物的积聚可导致患者神志淡漠或烦躁、抽搐、昏迷等神经系统症状的加重，甚至造成并发症死亡。因此，卒中后评估并采取必要措施保护肾功能是降低急性卒中患者院内死亡风险的先决条件，这也直接影响到患者受损的神经功能的近期及远期恢复。因此，在治疗急性脑梗死神经功能缺损的同时，针对肾损伤的治疗有其重要意义。

本实验通过肾组织HE及Masson染色观察发现，ACI大鼠肾脏组织在第1天、第3天时可见少量肾小管上皮细胞肿胀；在第7天时出现肾小管上皮细胞水肿、坏死、刷状缘消失；第14天时损伤持续加重，说明脑梗死大鼠肾组织存在实质性的损伤，这与前人观察大鼠脑梗死会引起肾组织损伤结果相一致。张新江等[10]发现脑缺血再灌注6 h时大鼠肾小管上皮细胞出现浑浊肿胀；24 h后观察到肾小球毛细血管腔闭锁，体积缩小，远曲小管和集合管上皮细胞广泛坏死[11]。伍丽娜等[12]在大鼠脑缺血再灌注后2 h、24 h、48 h时观察发现肾小管上皮细胞水肿，并有核固缩的表现，伴炎性细胞浸润,其他研究同样发现脑缺血再灌注后大鼠肾小管上皮细胞变性，有蛋白管型[13]。以上实验观察时间多在72 h内，而随着脑梗死时间的延长，肾组织形态及功能改变未做持续研究。本实验与以往研究相比，持续动态观察发现后期肾组织表面有散在出血点，肾组织出现纤维化，肾功能生化指标持续升高，表明肾组织存在损伤，且随时间的延长，损伤逐渐加重。

肾小球滤过、重吸收功能下降，会引起Cr、BUN浓度升高，而CysC血清浓度与肾功能损害程度高度相关。本研究中发现与假手术组相比，模型组Cr浓度第1天、第3天差异不显著；至第7天、第14天出现明显上升，术后模型组大鼠CysC、BUN浓度持续升高并分别在术后第3天、第7天达到峰值，而由此我们推测脑梗死急性期身体处于“应激”状态，会引起肾素-血管紧张素等过度分泌，导致肾脏血管剧烈收缩，血管痉挛供血不足而缺氧，当血管重新开放又引起肾缺血再灌注损伤，肾血浆流量及肾排泄滤过能力下降，Cr、BUN不能顺利随尿排出[14],从而出现血内肌酐、尿素氮、胱抑素C的持续升高[15,16]，同时也表明卒中后引起肾组织的持续性损伤。随后CysC浓度逐渐降低，可能是因为CysC作用于半胱氨酸的巯基，对半胱氨酸酶的活性进行调节，对缺血性脑卒中起脑保护作用，与赵德强等[17]观察缺血性脑卒中患者血清CysC变化的结果相一致。本研究病理结果显示脑梗死术后1 d、3 d时肾组织损伤不明显,而损伤初期尿素氮显著升高，不排除脑梗死初期尿素氮浓度与外源性(蛋白质摄入量)、内源性(感染、肾上腺皮质激素的应用、胃肠出血等)尿素负荷的大小有关[18]。这些不确定因素都会导致尿素氮的水平不稳定，故我们推测本实验中BUN浓度在初期升高可能和应激反应、炎症等内源性反应有关，导致肾功能上的损伤；在第14天降低可能与大鼠后期饮食、饮水量的改变等外源性因素有关。

急性脑梗死后根据肾损伤的发病原因，临床上将其分为内源致病因素和外源致病因素，外源致病因素主要是对比剂、甘露醇及溶栓治疗等引起的肾损伤；内源致病因素导致的肾损伤为脑部病变直接引起的急性肾损伤[19]，可能因缺血后脑缺血和水肿引起神经内分泌功能紊乱、交感神经兴奋、肾素-血管紧张素分泌增加、肾血管舒张功能障碍，从而造成肾小管缺血性坏死[20]。同时，脑损伤导致机体应激和炎症反应[21]，引起有害物质代谢能力下降，而炎症因子激活免疫细胞和产生活性氧，可直接引起肾组织细胞损伤和肾血管痉挛，进一步加重肾损伤，导致神经源性肾功能障碍或急性肾衰竭[22,23]。此外，卒中可导致机体血容量下降，肾血管灌流不足，肾小球滤过率下降，引起肾前性AKI[24]。本研究中模型组Cr、BUN、CysC维持较长时间的高数值，提示脑梗死对肾功能的损伤是持续的，临床中对脑梗死的治疗应在卒中早期注意保护肾功能，避免肾性缺血，同时持续改善脑缺血，减轻神经内分泌功能紊乱，减轻内源性肾功能损害。本实验中不足之处未记实验大鼠尿量及测定24 h尿蛋白，不能精确测定大鼠尿量改变；同时未设置治疗组，未进行卒中后肾功能损伤的针对性治疗，后续的实验我们将会进一步设置治疗组，探索有效的治疗方法，为临床急性脑梗死后肾功能的改善提供治疗依据。