长链非编码RNA在特发性肺纤维化中的研究进展

杨赟 邱慧 周军

苏州大学附属第三医院 常州市第一人民医院呼吸内科213000

特发性肺纤维化 (idiopathic pulmonary fibrosis，IPF)是一种慢性进行性纤维化性间质性肺炎，病变局限于肺部，主要发生于老年男性，IPF的病理生理特征包括肺泡上皮损伤、炎细胞浸润、成纤维细胞过度增殖以及细胞外基质沉积。IPF的临床表现为进行性加重的呼吸困难，伴限制性通气功能障碍和气体交换障碍，导致低氧血症甚至呼吸衰竭。纤维化反应包含4个主要阶段：第一阶段是由器官的原发性损伤驱动纤维化反应的开始；第二阶段是效应细胞的活化；第三阶段是细胞外基质的加工；第四阶段是肺纤维化阶段。后3个阶段相互重叠，促进细胞外基质的动态沉积 (和不充分的再吸收)，促进纤维化进展，最终导致终末器官衰竭[1]。

1 IPF的发病机制

IPF可能是由环境暴露 (包括香烟烟雾)和遗传易感性之间的相互作用引起的[2]。研究表明，表观遗传机制在IPF的发生、发展中发挥重要作用。表观遗传修饰包括DNA甲基化、非编码RNA和组蛋白修饰。在一项包含94例IPF患者和67名对照者的DNA甲基化大型临床研究中，研究者发现IPF的DNA甲基化与结肠癌相似，甲基化不同的区域大都分布在CpG岛附近[3]。这种异常的甲基化模式加速IPF患者表观基因组的老化，使得IPF患者的人端粒逆转录酶和人端粒酶m RNA表达降低，端粒缩短，端粒酶的功能异常[4]。IPF患者肌成纤维细胞Fas启动子沉默，组蛋白去乙酰化减少。相反，阻止组蛋白去乙酰化可以促进成纤维化细胞凋亡，恢复纤维化抑制基因Thy-1的表达，减轻肺纤维化[5]。除遗传因素以外，肺泡上皮细胞的反复损伤、上皮-间质转化 (epithelial-mesenchymal transition，EMT)[6]、凝血功能、先天性和适应性免疫等也参与了IPF的发生、发展[2]。

2 长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)概述

人基因组上有30亿个碱基对，其中1.5%可以编码蛋白质，98.5%为非蛋白质编码基因[7]。大量非编码RNA的研究提示这些不翻译成为蛋白质的RNA分子参与或主导了极其复杂的调控，可能有着比翻译成蛋白质的小部分RNA更重要的地位[8]。非编码RNA包括短链非编码RNA[如微小RNA(microRNA，miRNA)]和lncRNA。

miRNA是一类长度约为22个核苷酸的非编码小RNA，已发现miRNA参与细胞增殖、分化和凋亡[9]。目前研究已证实包括let-7d、miR-200、miR-26a和miR-375在内的许多miRNA参与IPF[10-13]。miRNA参与IPF的机制多种多样，miRNA可以通过调节肺损伤的早期炎症[14]、调节肺成纤维细胞的功能、调节DNA甲基化和组蛋白甲基化、抑制胶原沉积等参与IPF[9]。此外，miRNA可充当IPF早期诊断的生物标志物以及作为IPF的治疗靶点。与miRNA一样，非编码RNA的失调也参与IPF的发生、发展。

lncRNA是长度大于200个核苷酸的非编码RNA，根据基因位置可分为外显子重叠lncRNA、内含子重叠lncRNA、内含子反义lncRNA、天然反义lncRNA、双向lncRNA、基因间lncRNA 6种。lncRNA虽然不能编码蛋白质，却在表观遗传、转录、转录后和翻译水平具有重要调节作用，广泛参与许多重要的生物过程，如基因印记、细胞增殖和分化、免疫反应和染色体结构等，从而得到了研究界的广泛关注。近年来，越来越多的研究报道证实lncRNA参与调控IPF的发病过程。

3 IPF中异常表达的lncRNA

3.1 lncRNA AJ005396和S69206 2013年，Cao等[15]在博来霉素诱导的肺纤维化大鼠模型中发现568个差异表达的lncRNA，其中210个上调，358个下调。利用原位杂交的方法发现在肺纤维化大鼠的肺间质细胞的胞质中lncRNA AJ005396和S69206表达增加。UCSC数据库显示，AJ005396和S69206序列分别与COL11A1和RMCP-1重叠。在肺纤维化大鼠中，lnc RNA AJ005396和S69206上调，但是COL11A1和RMCP-1的表达没有显著差异。该实验首次发现了lncRNA在肺纤维化大鼠模型中的差异表达，但lncRNA具体的作用机制尚不清楚。

3.2 lncRNA MRAK088388和MRAK081523 竞争性内源RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)的概念于2011年被提出[16]，该假说揭示了一种RNA间相互作用的新机制。已知miRNA可以通过结合m RNA导致基因沉默，而ceRNA可以通过应答元件竞争性结合miRNA，从而阻止miRNA与靶基因的结合，逆转miRNA导致的基因沉默。2014年，Song 等[17]发现 MRAK088388 和MRAK081523能够分别通过竞争性结合miR-29b-3p和let-7i-5p调控N4bp2和Plxna4的表达。此外，通过原位杂交发现MRAK088388和MRAK081523位于肺间质细胞的细胞质中。该研究初步提出了lncRNA作为ceRNA竞争性结合miRNA调节基因的表达，从而导致肺纤维化的发生。

3.3 lncRNA uc.77和2700086A05Rik EMT是指上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型细胞的过程，主要表现为上皮细胞标志的失去和间质细胞标志的获得，同时细胞形态变为纺锤形，失去与基底膜的连接，从而获得迁移能力。已有的体内和体外研究证明，EMT是IPF肺组织中肌成纤维细胞的重要来源，并且在IPF肺组织标本中证实气道上皮细胞和肺泡上皮细胞均能够发生EMT[18]，EMT在肺纤维化的形成和发展过程中发挥了重要作用。2015年，Sun等[19]发现lncRNA uc.77和2700086A05Rik分别通过调节靶基因ZEB2和HOXA3来参与EMT，从而参与肺纤维化的发展。该研究结果揭示了lncRNA在肺纤维化过程中调控EMT的重要作用。

3.4 lncRNA n341773和CD99P1 Huang等[20]发现34种lncRNA与miRNA有潜在的结合位点，其中有23种在人肺组织中表达。在23种lncRNA中，发现9种lncRNA在IPF中表达失调：n370929、CD99P1、NR_003085、n338680、n341773和n364035表达下调，n342143、n373263和NR_045756表达上调。进一步研究发现，lncRNA n341773增加肺成纤维细胞的胶原表达，CD99P1抑制肺成纤维细胞增殖和肌成纤维细胞分化。这一发现可能为IPF的治疗提供新的方向。

3.5 lncRNA CHRF 据报道，lncRNA CHRF通过ceRNA机制竞争性结合miR-489，从而解除miR-489对心肌肥厚中靶基因的抑制[21]。2016年，Wu等[22]通过miRNA芯片筛检发现miR-489在二氧化硅诱导的肺纤维化肺组织中明显降低，通过对miR-489的深入研究，发现在整体动物水平上调miR-489可减轻矽尘诱导的肺纤维化；在细胞水平通过构建矽尘诱导的巨噬细胞模型和转化生长因子β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)诱导的成纤维细胞模型，发现miR-489主要通过调控炎症通路重要分子MyD88和TGF-β通路重要分子Smad3来减轻矽尘诱导的肺纤维化，lncRNA CHRF可吸附miR-489，解除其对靶基因MyD88和Smad3的抑制作用，进而激活炎症和纤维化信号通路，表明lncRNA CHRF/miR-489/MyD88 Smad3信号轴在二氧化硅诱导的肺纤维化中发挥关键作用。

3.6 lncRNA H19 据报道，lncRNA H19与多种疾病密切相关。Xie等[23]发现lncRNA H19上调促进肾纤维化。Zhu等[24]发现lncRNA H19/miR-675轴通过靶向TGFBI抑制前列腺癌转移。miR-141和lncRNA H19之间相互作用，在胃癌中调节细胞增殖和转移[25]。2016年，Tang等[26]证实lncRNA H19通过与miR-29b相互作用调控肺纤维化，两者呈负相关，并且lncRNA H19与肺纤维化基因COL1A1和Acta2的表达呈正相关。2018年，Lu等[27]进一步研究发现，在博来霉素诱导的小鼠模型和TGF-β诱导的活化成纤维细胞中lncRNA H19的表达上调，并且敲除lncRNA H19减轻了肺纤维化，这与Tang等[26]的研究结果一致。此外，Lu等[27]还发现lncRNA H19作为ceRNA通过与miR-196a结合调节COL1A1的表达，从而调节肺纤维化进展。

3.7 lnc-PCF TGF-β1能够诱导许多细胞的形态学和细胞表型转化，包括EMT，是肺纤维化的形成中关键的致纤维化细胞因子之一。2017年，Liu等[28]发现lnc-PCF可以通过调节TGF-β1激活的上皮细胞的增殖来促进纤维化，进一步的实验证实，lnc-PCF促进活化上皮细胞的增殖依赖于miR-344a-5p，miR-344a-5p通过其靶基因map3k11发挥调控功能。这些结果表明，lnc-PCF可以通过直接靶向miR-344a-5p来调控map3k11，从而加速肺纤维化，这可能是IPF潜在的治疗靶点。

3.8 lncRNA PCAT29 lncRNA PCAT29与前列腺癌相关。Malik等[29]发现敲除lncRNA PCAT29能够促进前列腺癌细胞的增殖和迁移。Liu等[30]证实过表达lncRNA PCAT29可改善肺纤维化，并且lncRNA PCAT29通过TGF-β1介导的RASAL1/ERK1/2信号通路抑制肺成纤维细胞分化，TGF-β1介导的信号通路受miR-221的调节。

3.9 lncRNA-ATB 2018年，Liu等[31]通过构建矽尘诱导的小鼠肺纤维化模型，发现miR-200c的表达水平明显降低，而在小鼠体内高表达miR-200c后对矽尘诱导的肺纤维化有一定阻滞作用。通过细胞实验，进一步发现巨噬细胞可以通过分泌TGF-β1促进肺上皮细胞lncRNA-ATB表达升高，通过结合吸附的方式降低游离miR-200c水平，释放miR-200c的靶基因ZEB1，促进肺纤维化过程中肺泡上皮细胞EMT的发生、发展，从而阐明了lncRNA-ATB参与肺泡上皮细胞EMT的分子机制。

3.10 lncRNA PFAL 随着对lncRNA研究的深入，2018年Li等[32]发现lncRNA PFAL在博来霉素诱导的肺纤维化模型中及TGF-β1诱导的纤维化肺成纤维细胞中表达升高，进一步研究表明lncRNA PFAL可通过调节miR-18a导致肺成纤维细胞中的细胞外基质沉积和纤维化发生。另外，在动物水平和细胞水平敲除lncRNA PFAL均可减轻肺纤维化。

3.11 lncRNA CDKN2B-AS1 先前已有研究证实IPF患者的肺癌发病率高于健康人，IPF被认为是肺癌的独立危险因素[33]。Du等[34]发现lncRNA CDKN2B-AS1可能通过调控它的邻近基因m RNA CDKN2A影响p53信号通路，导致肺纤维化合并肺癌的风险增高；另外，通过体外实验，进一步证实了lncRNA CDKN2B-AS1通过调控CDKN2A发挥作用。

3.12 lncRNA PFRL IPF患者病死率高，预后差，诊断后中位生存期为2～4年。2018年，Jiang等[35]发现miR-26a可以减轻博来霉素诱导的小鼠肺纤维化，而lncRNA PFRL是生物信息学分析预测的唯一与miR-26a有潜在结合位点的lncRNA。因此，Jiang等利用博来霉素和TGF-β1分别在体内和体外水平构建肺纤维化模型，发现肺纤维化模型中lncRNA PFRL表达升高，进一步研究表明lncRNA PFRL可通过miR-26a诱发肺成纤维细胞胶原合成，促进肺成纤维细胞增殖、迁移和分化。同时，敲除lncRNA PFRL可以减轻TGF-β1诱导的肺成纤维细胞的纤维化以及博来霉素诱导的小鼠肺纤维化。lncRNA PFRL在IPF中表达升高以及其对miR-26a的调控作用可能作为肺纤维化疾病防治的新靶点。

3.13 lncRNA PFAR 2018年9月，Zhao等[36]首次发现lncRNA PFAR作为miR-138的ceRNA，通过调节YAP1-Twist轴促进肺成纤维细胞活化和细胞外基质沉积，更重要的是，沉默lncRNA PFAR抑制了博来霉素诱导的小鼠肺纤维化。这些结果表明lncRNA PFAR可能是预防和治疗肺纤维化的新策略。

IPF的发病机制不明，预后不良，病死率高，缺乏有效的治疗措施，目前已受到越来越多的关注。近年来，随着功能基因组学的飞速发展，人们已经逐渐认识到lncRNA在IPF的发病机制中有着重要的作用，并可能成为潜在的生物标志物和治疗靶点。研究发现，肺纤维化组织和正常的肺组织中存在数百种差异表达的lncRNA，lncRNA作为ceRNA竞争性结合miRNA，调控靶基因的表达，从而参与EMT，促进肺纤维化的发生、发展，受到了广泛的关注，但具体的分子机制仍有待进一步研究。由此可见，失调的lncRNA可能是包括肺纤维化在内多种疾病的重要生物学标志，进一步深入研究lncRNA在IPF中的作用机制并对其特定靶点实施干预，可能为IPF的治疗提供新的思路。

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