鲁氏酵母和球拟酵母不同接种方式 对高盐稀态酿造酱油品质的影响

郭建，伍学明，樊君，左上春，刘英

(1.千禾味业食品股份有限公司，四川 眉山 620000；2.四川省调味品添加剂工程技术中心，四川 眉山 620010)

酱油是一种起源于我国的传统发酵食品，它的历史可以追溯到2000多年前[1]。目前，酱油的酿制方法包括高盐稀态发酵、低盐固态发酵和固稀结合的发酵方式[2]，其中高盐稀态发酵方法日益成为国内酱油酿制的主流方法。高盐稀态酿造方法便于实现工业化、节约化、清洁化生产，并且采用高盐稀态法酿制的酱油呈香浓郁、品质优良。

多种微生物参与到酱油酿造过程中[3]，伴随发酵的进行，酱醪微生物呈现此消彼长，菌群不断更替，赋予酱油丰富浓厚的滋味。在众多的微生物中，耐盐酵母是酱油酿造的主发酵菌株，耐盐酵母产生的酯类、醇类、醛类等物质对酱油的香味影响最大[4]。用于酱油酿造的耐盐酵母主要包括鲁氏酵母、球拟酵母和假丝酵母，其中尤以鲁氏酵母和球拟酵母应用最广。关于鲁氏酵母和球拟酵母的报道较多，但是不同来源的鲁氏酵母和球拟酵母对于酿造酱油的影响缺乏研究，本文选取4株具有代表性的鲁氏酵母和球拟酵母应用于酱油发酵，并深入考察了它们对酱油风味物质形成的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

米曲霉3.402，莫格球拟酵母CICC 1708，白球球拟酵母CICC 1019，鲁氏接合酵母CICC 1379和CICC 1417：购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.1.2 培养基

1.1.2.1 耐盐酵母斜面培养基

酵母粉10 g/L，葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，氯化钠100 g/L，琼脂粉20 g/L。

1.1.2.2 耐盐酵母液体培养基

酱油原油，氯化钠120 g/L，葡萄糖60 g/L。

1.1.2.3 制曲培养基

小麦炒熟，豆粕在121 ℃条件下灭菌20 min，然后按照小麦∶豆粕为3∶7的比例进行混合，接种种曲后于30 ℃培养得成曲。

1.1.3 仪器与设备

Alkomat酒精检测仪 德国福林斯生化技术有限公司；分光光度计 上海仪电分析仪器有限公司；GC-MS气质联用仪 安捷伦科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 酵母培养

鲜虾中添加9%，12%，15%的食盐，于4 ℃冰箱中冷藏，每15天取样观察并检测虾酱理化及微生物指标。

1.2.2 发酵

配制23%的盐水，按大曲∶盐水为1∶2加入盐水，搅拌均匀后于33 ℃培养箱中发酵。

1.2.3 接种耐盐酵母

单独接种鲁氏酵母或者球拟酵母按照106/mL的接入量接入，发酵第7天接入耐盐酵母。组合接入鲁氏酶和球拟酵母的方法：发酵第7天接入鲁氏酵母，发酵第22天接入球拟酵母。

1.2.4 检测方法

1.2.4.1 生香酵母生长性能的测定

在斜面培养基培养生香酵母于30 ℃培养2 天，之后用接种针接入1环至耐盐酵母液体培养基中，其中氯化钠的加入量分高盐(18%)和低盐(12%)2种，于30 ℃培养，间隔4 h取样。将待测样液10倍稀释后用分光光度计测定吸光度值。

1.2.4.2 还原糖的测定

酱油还原糖的测定采用DNS法，具体步骤参照Zhu等[5]的方法。

1.2.4.3 乙醇浓度的测定

取100 mL待测酱油，加入100 mL蒸馏水，经蒸馏后得100 mL馏出液，将馏出液用Alkomat酒精检测仪测定酒精度即可。

1.2.4.4 酱油关键性呈香物质浓度的测定

采用王春玲等的测定方法测定4-EG和HEMF的浓度[6]，采用Agilent 5977E GC/MSD气质联用仪和CBP-20 极性毛细管柱(50 m×0.25 mm)。色谱条件：起始温度60 ℃，保持10 min，以5 ℃/min进行升温，最终温度180 ℃，保持15 min；氢气流速47.0 mL/min，空气流速400.0 mL/min，分流比20∶1，FID 检测器，检测器温度250 ℃，进样口温度 250 ℃，进样量1 μL。

1.2.5 数据分析

所有试验均做3个平行，数据显示为平均值±均方差。

2 结果与分析

2.1 生香酵母生长性能比较

在液体培养条件下，对2株鲁氏接合酵母和2株球拟酵母在高盐(18%)和低盐(12%)2个浓度下的生长性能进行了比较(见图1)。高盐条件下，莫格球拟酵母CICC 1708的生长性能明显优于其他3株菌，白球球拟酵母CICC 1019的生长最为缓慢，2株鲁氏接合酵母CICC 1379和CICC 1417生长性能则差别不大。

与高盐条件下相似，低盐条件下莫格球拟酵母CICC 1708依然生长最快，而白球球拟酵母CICC 1019的生长最慢，但是所有生香酵母的生长性能明显优于高盐条件，说明随着盐浓度的提高，生香酵母的繁殖受到了明显的抑制。

目前，国内酿造酱油主要采用高盐稀态的酿制方法，因此需要在高盐条件下发酵性能优越的菌株。当然，仅具备高盐条件下良好的生长性能是不够的，还需要耐盐酵母生成丰富的呈香物质以提升酱油品质。

图1 生香酵母在高盐(A)和低盐(B)条件下的生长曲线Fig.1 The growth curve of aroma-producing yeasts under high-salt(A) or low-salt(B) condition

2.2 氨基酸态氮在发酵过程中的变化

通过Ehrlich途径，生香酵母可以将酱醪中的氨基酸转化为短链脂肪酸和短链支链醇[7]。适量地将酱油中的氨基酸转化为短链脂肪酸和短链支链醇有助于改善酱油风味、提升酱油品质，而氨基酸过多地消耗则有损酱油品质。不同的生香酵母利用氨基酸的能力存在差异，因而生香酵母的加入可能导致酱醪中氨基酸态氮的含量发生变化。在发酵第10天分别接种4种生香酵母，并分别测定了发酵过程中氨基酸态氮的变化情况。

图2 分别接种4种生香酵母后氨基酸态氮的变化Fig.2 Changes of amino acid nitrogen after inoculation with four different aroma-producing yeasts

由图2可知，随着发酵的进行，接种不同菌株的酱醪中氨基酸态氮无显著差异，最终氨基酸态氮都在1.2 g/dL左右，表明这4种酵母对氨基酸态氮的生成影响有限。

2.3 总酸在发酵过程中的变化

酱油总酸的主要成分包括氨基酸、乙酸、乳酸等酸类物质，这些酸类物质对酱油品质影响很大。呈味氨基酸会赋予酱油更温和的鲜味，乙酸、乳酸等酸类能增强酱油的滋味，乙酸、乳酸等还可经酶的作用进一步转化为酯类、醇类等呈香物质。接种4种不同生香酵母后酿造酱油的总酸变化见图3。

图3 分别接种4种生香酵母后总酸的变化Fig.3 Changes of total acid after inoculation with four different aroma-producing yeasts

由图3可知，发酵前30天，总酸增长最为迅速，这与氨基酸态氮的生成量一致，表明发酵前30天总酸的主要成分为氨基酸。发酵30天以后，总酸增长较为缓慢，在这一阶段主要归因于乳酸的快速繁殖致使乳酸、乙酸等大量积累。陈伯林的研究显示，酱醪发酵前期主要是蛋白酶解及乳酸菌等细菌快速生长阶段，随着酱醪pH降低至5.0～5.5左右，酵母菌开始大量繁殖，菌落群态的更替引起酱醪中呈味物质的显著变化[8]。接种不同生香酵母的酱醪总酸差异不大，其中接种酵母菌株CICC 1379的酱醪总酸最低，接种不同酵母菌株引起的总酸含量的细微差异可能是酱醪中微生物菌落群态发生改变所致。

2.4 还原糖在发酵过程中的变化

糖类物质对酱油滋味影响较大。首先，酱油甜味的形成主要归因于酱油中含有的葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、麦芽糖等，这些糖类是经由米曲霉分泌的酶类水解淀粉类物质和木质纤维素类物质形成的[9]。其次，酱油中糖类物质能经由美拉德反应或者微生物代谢转化为色素，进而引起酱油风味的变化。分别接种4种生香酵母后还原糖的变化见图4。

图4 分别接种4种生香酵母后还原糖的变化Fig.4 Changes of reducing sugar after inoculation with four different aroma-producing yeasts

由图4可知，在发酵前30天，还原糖含量呈现显著的上升趋势，这是由于米曲霉分泌的淀粉酶、纤维素酶水解原料产生了大量的糖类，同时发酵前期微生物生长缓慢，产生的糖类物质大于消耗的量，进而引起还原糖含量的显著上升。图4结果显示，接种球拟酵母后酱醪的还原糖含量低于接种鲁氏酵母的还原糖含量，这是因为随着发酵的进行，酱醪的pH逐渐降低，鲁氏酵母耐受pH的能力不如球拟酵母，在发酵后期，鲁氏酵母消亡而球拟酵母仍然能够生长，较强的菌体活力使得球拟酵母的耗糖能力优于鲁氏酵母。

2.5 关键性呈香物质在发酵过程中的变化

4-EG和HEMF是酱油中的关键性呈香物质，乙醇是生香酵母产生的主要醇类物质。4-EG是由球拟酵母将阿魏酸和4-羟基桂皮酸转化而得[10]，HEMF则是D-木酮糖-5-磷酸经酵母转化产生的。分别接种4种生香酵母后90天这些关键性呈香物质的变化见图5。

图5 接种不同生香酵母产4-乙基愈 创木酚、乙醇和HEMF结果比较Fig.5 Comparison of the content of 4-EG, alcohol and HEMF in soy sauce inoculated with different aroma-producing yeasts

由图5可知，鲁氏酵母CICC 1379所产乙醇含量最高(2.79 g/L)，球拟酵母CICC 1708所产乙醇含量最低(2.13 g/L)。总体而言，接种鲁氏酵母的乙醇产量比接种球拟酵母的高。图5结果显示，球拟酵母CICC 1708产生4-EG的能力最强，达到1.103 g/L，CICC 1019产生4-EG的能力稍弱，而接种2株鲁氏酵母的酱醪4-EG含量最低。王春玲等的研究指出鲁氏酵母只产生HEMF不产生4-EG，而研究结果却发现单独接种鲁氏酵母后仍有微量4-EG生成，这可能是发酵过程中引入了野生型酵母或者酵母菌株本身的发酵特性决定的。同时本研究发现不论接种鲁氏酵母还是球拟酵母酱醪中都会产生HEMF，但是接种鲁氏酵母后HEMF的含量更高，其中接种鲁氏酵母CICC 1417后酱醪中的HEMF达到0.048 g/L。

2.6 同时接种鲁氏酵母和球拟酵母对酿造酱油香气成分影响

上述结果显示：球拟酵母和鲁氏酵母产生的关键性呈香物质存在差异，那么同时接种鲁氏酵母和球拟酵母能否强化这些关键性呈香物质的合成呢？同时接种不同鲁氏酵母和球拟酵母对酱油关键性呈香物质的影响见表1。

表1 生香酵母在高盐(A)和低盐(B)条件下的生长曲线Table 1 The growth curve of aroma-producing yeasts under high-salt(A) or low-salt(B) condition

注：1为同时接种CICC 1708和CICC 1417；2为同时接种CICC 1708和CICC 1379；3为同时接种CICC 1019和CICC 1417；4为同时接种CICC 1019和CICC 1379。

由表1可知，同时接种鲁氏酵母和球拟酵母组合方式，4-EG和HEMF含量都得到不同程度的提高：同时接种CICC 1708和CICC 1417后4-EG和HEMF含量最高，分别达到1.26,0.063 g/L，较单独接种鲁氏酵母或球拟酵母效果好。同时接种鲁氏酵母和球拟酵母后，乙醇含量也较单独接种强，其中接种CICC 1019和CICC 1379后乙醇含量最高，达到3.35 g/L。有研究表明鲁氏酵母和球拟酵母存在拮抗效应[11]，拮抗效应的存在可能最终影响酱油风味物质的形成，但是对于风味物质的影响仍然缺乏研究。本研究通过不同鲁氏酵母和球拟酵母的组合接种，探究对关键性呈香物质形成的影响，这对提升酱油品质具有重要的理论指导意义。

3 结论

通过单独或组合接种2株鲁氏酵母和2株球拟酵母的方式，深入考察了鲁氏酵母和球拟酵母对酿造酱油品质的影响。发现组合接种鲁氏酵母和球拟酵母的方式优于单独接种鲁氏酵母或球拟酵母，其中同时接种CICC 1708和CICC 1417后4-EG和HEMF含量最高，分别达到1.26，0.063 g/L。本研究深入揭示了鲁氏酵母和球拟酵母对酱油关键性指标的影响，为提升酱油品质提供了指导。